Technologia produkcji insuliny

Analizy

Insulina jest jednym z hormonów wytwarzanych przez sam ludzki organizm, w szczególności przez trzustkę. Naruszenie wydzielania tej substancji prowadzi do pojawienia się tak poważnej choroby, jak cukrzyca. Do jego leczenia wykorzystuje się syntetyczny hormon, który przez długi czas izolowany jest od trzustki zwierząt gospodarskich. Jednak technologia wytwarzania insuliny za pomocą bardzo powszechnej bakterii - Escherichia coli lub grzyba drożdżowego była stosowana przez dość długi czas. Użycie tej metody pozwala uniknąć reakcji alergicznych wywołanych przez obce białko, które nieznacznie różni się od człowieka.

Schemat technologiczny

Technologia produkcji insuliny obejmuje wszystkie główne etapy produkcji produktów biotechnologicznych. Wynikiem jest krystaliczny produkt końcowy, który jest następnie używany do przygotowania roztworów do wstrzykiwań stosowanych w leczeniu ciężkiej cukrzycy typu I i II. Główny wpływ tego hormonu w organizmie przejawia się w obniżeniu poziomu glukozy zawartej we krwi.

Etapy wytwarzania insuliny będą następujące:

Wstępny. Prowadzi takie operacje, jak przygotowanie i oczyszczanie wody i powietrza, czyszczenie pomieszczeń przemysłowych i sterylizacja sprzętu, kontrola personelu, przetwarzanie rąk i wydawanie sterylnych butów i odzieży. Również na wstępnym etapie powstaje podstawowa synteza chemiczna łańcuchów cząsteczkowych, z których składa się białko. Łańcuch A zawiera 21 reszt aminokwasowych, a łańcuch B zawiera 30 aminokwasów.
Przygotowanie roztworów odżywczych i kultury komórkowej. Aby żywa komórka wytworzyła niezbędny związek, wprowadzono odpowiedni gen. W tym celu plazmid jest przecinany przez specjalne enzymy, restrykazy, a do niego wszywane są geny kodujące syntezę niezbędnych związków. Następnie, stosując metodę mikroiniekcji, zmodyfikowany plazmid powraca do komórki.
Hodowla zawiesiny komórek. Genetycznie zmodyfikowane komórki umieszcza się w roztworze odżywczym, posiadającym wszystkie składniki niezbędne do wzrostu i rozmnażania oraz poddawania sterylizacji. Uprawa kultury odbywa się w specjalnych bioreaktorach, w których jest zasilane wstępnie oczyszczone powietrze. Okresowo do reaktora dodaje się pewną ilość roztworu pożywki i jednocześnie pobiera się tę samą objętość zawiesiny komórkowej.
Podział kultury. Oddzielenie płynu i hodowli komórkowej odbywa się poprzez sedymentację (sedymentacja) w specjalnych osadnikach, a następnie filtrację, która pozwala zachować integralność komórek.
Chromatograficzne oczyszczanie substancji. Przeprowadza się go na odpowiednim sprzęcie, stosując różne metody, w szczególności chromatografię czołową, anionowymienną i permeacyjną żel.
Pobieranie cząsteczki białka. Na właściwym etapie biotechnologii następuje synteza nie produkowanej cząsteczki insuliny. I dwa składniki jego łańcuchów. Są one szyte po utlenianiu i składaniu otrzymanych łańcuchów, co powoduje powstawanie mostków dwusiarczkowych.
Liofilizacja w specjalnym piecu, po czym powstały krystaliczny preparat sprawdza się pod kątem zgodności ze standardem, pakuje się, oznakowuje i wysyła do konsumenta.

Nasza firma na korzystnych warunkach oferuje gotowe linie produkcyjne, w których cała technologia produkcji insuliny jest w pełni przestrzegana. Dzięki dokładnym kalkulacjom, wsparciu technicznemu i informacyjnemu, a także szkoleniu personelu w ramach kompleksowego programu, firma będzie rentowna, a jej produkty będą poszukiwane.

Wykrywanie insuliny

Obecnie cukrzyca dotyka ponad 400 milionów ludzi na świecie, co stanowi około 8% dorosłej populacji globu. Zgodnie z rejestrem państwowym ponad 3,3 miliona osób cierpi na cukrzycę w Rosji (około 300 tysięcy osób cierpi na cukrzycę typu 1, a około 3 miliony osób cierpi na cukrzycę typu 2). Jednak dane te raczej nie odzwierciedlają rzeczywistej sytuacji. Wszyscy ci ludzie, żyjący każdego dnia, rozumieją, że ich życie zależy od insuliny.

Pierwsze próby leczenia cukrzycy zostały wykonane przed naszą erą. Starożytni greccy i rzymscy lekarze stosowali ten masaż, gimnastykę, kąpiele, aromaterapię i wiele innych. W XIX wieku dla diabetyków opracowano dietę mięsną o niskiej zawartości węglowodanów. Pierwsza próba leczenia cukrzycy za pomocą wstrzyknięć insuliny została podjęta w 1921 roku. Kanadyjski naukowiec Frederick Banting stał się pierwszą osobą, która używa hormonu insuliny do kontrolowania cukrzycy. Miał tylko 32 kody, kiedy otrzymał Nagrodę Nobla w medycynie. Stworzył lek skutecznie i bez skutków ubocznych obniżył poziom glukozy z 28,9 do 6,7 mmol / l. Ten narkotyk dał nadzieję wielu ludziom na życie.

W 1869 r. Naukowiec Paul Langergans odkrył grupy komórek trzustki, nazwane później "wyspami Langerhansa". Następnie izolowano insulinę z komórek tych wysp. Insulina jest hormonem regulującym metabolizm, głównie węglowodanów (cukrów), ale także tłuszczów i białek. W cukrzycy z powodu niewystarczającej ekspozycji na insulinę występuje złożone zaburzenie metaboliczne, wzrost poziomu cukru we krwi (hiperglikemia), cukier jest wydalany z moczem (glikozuria), a kwaśne produkty upośledzonego spalania tłuszczu pojawiają się w ciałach krwi - keton (kwasica ketonowa).

Po odkryciu insuliny wielu naukowców zaczęło opracowywać metody oczyszczania tego leku, ponieważ to zanieczyszczenia mają szkodliwy wpływ na osłabione ciało.

Agilent Technologies jest światowym liderem w dziedzinie urządzeń analitycznych. Urządzenia do analizy chromatograficznej i spektralnej od ponad roku pomogły naukowcom na całym świecie rozwiązać istotne problemy farmaceutyków. Kontrola czystości insuliny nie jest wyjątkiem. Wcześniej do tych celów stosowano klasyczną chromatografię cieczową, uzyskując całkiem akceptowalne wyniki:

Po wielu badaniach naukowcy udowodnili, że utworzony polipeptyd insuliny o masie cząsteczkowej około 6000 jest skutecznie identyfikowany przy użyciu najnowszych osiągnięć w dziedzinie chromatografii wykluczania.

Za pomocą tej nowej metody można porównać "dobrą insulinę", która była przechowywana w zalecanych warunkach i "złej insuliny". Gdy dwa chromatogramy nałożono na siebie nawzajem, okazało się, że w preparacie insuliny, który był przechowywany w niekorzystnych warunkach, cząsteczka docelowa została zniszczona, a zamiast niej na chromatogramie zidentyfikowano produkty rozkładu.

Rozwój i unifikacja metod analizy i standaryzacji preparatów insuliny za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP HPLC) Pihtar Anatolij Wasiliewicz

Ta rozprawa doktorska powinna trafić do biblioteki w niedalekiej przyszłości.
Powiadamiaj o przyjęciu

Praca dyplomowa - 480 rubli. Dostawa 10 minut, przez całą dobę, siedem dni w tygodniu i święta.

Streszczenie - 240 rubli, dostawa 1-3 godzin, od 10-19 (czasu moskiewskiego), z wyjątkiem niedzieli

Pihtar Anatolij Wasiliewicz. Opracowanie i unifikacja metod analizy i standaryzacji preparatów insuliny za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP HPLC): rozprawa. Kandydat do Nauk Farmaceutycznych: 15.00.02 / Pihtar Anatolij Wasiliewicz; [Miejsce ochrony: Moskiewska Akademia Medyczna "].- Moskwa, 2005.- 139 str.: Il.

Treść rozprawy

ROZDZIAŁ 1. Przegląd literatury 11

1. Rola insuliny w leczeniu cukrzycy 11

2. Biosynteza i biologiczne działanie insuliny 12

3. Ogólna charakterystyka właściwości fizykochemicznych i farmaceutycznych insuliny 15

4. Preparaty insuliny 24

5. Metody produkcji, standaryzacja i kontrola jakości preparatów insuliny 31

6. Zastosowanie HPLC w analizie farmaceutycznej insuliny. 46

ROZDZIAŁ 2. Opis problemu 50

ROZDZIAŁ 3. Badanie wpływu różnych czynników na zachowanie chromatograficzne insuliny w warunkach RP HPLC 56

1. Metody i materiały 57

2. Omówienie wyników 62

2.1. Wpływ składu roztworu buforowego 62

2.2. Wpływ stężenia siarczanu sodu 68

2.3. Wpływ temperatury kolumny chromatograficznej 70

2.4. Wpływ modyfikatora organicznego 75

2.5. Wpływ długości rodnika alkilowego przeszczepionej fazy 80

2.6. Wpływ długości kolumny chromatograficznej 80

ROZDZIAŁ 4. Polepszenie farmakopealnych metod analizy preparatów insuliny na podstawie zastosowania RP HPLC 82

1. Wybór optymalnych warunków dla chromatograficznego oznaczania insuliny i jej zanieczyszczeń w preparatach medycznych 82

2. Metrologiczne właściwości metody 84

3. Zastosowanie opracowanej metodologii testowania oficjalnych preparatów insuliny 95

ROZDZIAŁ 5. Opracowanie metod analizy wstrzykiwanych postaci dawkowania insuliny izofanowej w oparciu o metodę HPLC PF

1. Wybór warunków chromatograficznego oznaczania protaminy w postaciach dawkowania izofanu insuliny 110

2. Badanie profili chromatograficznych protamin izolowanych z różnych gatunków ryb 121

3. Metoda oznaczania protaminy w preparatach izofanu i insuliny 123

4. Walidacja opracowanej metodologii 125

Ogólne wnioski 136

Piśmiennictwo 139

Ogólna charakterystyka właściwości fizykochemicznych i farmaceutycznych insuliny

Z chemicznego punktu widzenia insulina jest małym kulistym białkiem o masie cząsteczkowej do 6000 Da. Jednocześnie należy zauważyć, że insulina jest powszechną nazwą dla całej rodziny homologicznych białek naturalnego i sztucznego pochodzenia o wspólnej charakterystycznej aktywności biologicznej. Białkowy charakter insuliny ustalono w 1928 r. [52]. Jest to jedno z białek, które produkują reakcję biuretową i reakcję Pauliego. Struktura insuliny została w pełni ustalona na początku lat 50-tych. Podstawowy skład chemiczny insuliny różnego pochodzenia charakteryzuje się liczbami podanymi w tabeli 1 [40].

Skład aminokwasowy. Większość cząsteczek insuliny zawiera 51 reszt aminokwasowych, spośród których 17 aminokwasów znajduje się w większości znanych białek.

Charakterystyczną cechą składu aminokwasowego insuliny bydlęcej, świńskiej i ludzkiej jest tryptofan i metionina. Skład aminokwasów tych typów insuliny przedstawiono w tabeli 2 [40,46].

Innym typem insuliny jest zawartość cystyny (6 reszt pół cystyny). Ponadto cząsteczka insuliny wszystkich typów zawiera 6 grup amidowych (asparagina, glutamina).

Po uwolnieniu insuliny, wraz z główną frakcją, można zaobserwować frakcje postaci dezamidowanych insuliny. W środowisku kwaśnym, w procesie dezamidacji, wszystkie 6 grup amidowych można stopniowo odszczepiać, a ruchliwość elektroforetyczna i chromatograficzna zmian insuliny [40]. Tworzenie deamidowanych postaci insuliny można ocenić na podstawie wyników oznaczania amoniaku. W przypadku w pełni amidowej postaci insuliny oznacza się 6 moli amoniaku na 1 mol białka, dla form dezamidowanych wartość ta może wynosić od 5 do 0.

Pierwotna struktura insuliny. Pierwotna struktura insuliny została rozszyfrowana przez grupę Sanger w latach 1945-1955. Poprzez szereg metod chromatograficznych, które pozostawiono do rozdzielenia i identyfikacji różnych peptydów, aminokwasów i ich pochodne, Sanger stanie ustalenia podstawowej struktury insuliny bydlęcej [130,131,132,133,134,135]. Dalsze badania insuliny z różnych źródeł, przy użyciu różnych metod fizyko-chemicznych, w tym metodą Edmana celem ustalenia sekwencji aminokwasowej całego długich peptydów potwierdziło wyniki struktury insuliny Senger i in [BB].

Do tej pory pierwotna struktura insuliny została ustalona u przedstawicieli 24 gatunków należących do 4 klas zwierząt: ssaków, ptaków, ryb i cyclostomów [14]. Trwają badania nad insuliną różnego pochodzenia [71, 772, 73].

Struktura insuliny u różnych zwierząt jest podobna, ale nie identyczna. W swojej pierwotnej strukturze insulina ludzka jest podobna do insuliny wieprzowej, psiej, kaszalotowej i króliczej, różniąc się tylko jednym aminokwasem [40]. Różni się od insuliny bydlęcej trzema aminokwasami. W większym stopniu insulina ludzka nie jest podobna do insuliny świnki morskiej, ptaków i ryb [40]. Różnice w sekwencji aminokwasowej insuliny ludzkiej, świńskiej i bydlęcej przedstawiono w Tabeli 3.

Pomimo różnic strukturalnych wszystkie typy insulin mają podobną aktywność biologiczną, tj. powodować hipoglikemię. Jednakże wartość wykazują aktywność biologiczną w dużym stopniu zależy od gatunku rośliny i jest w zakresie od 11 IU / mg (insulina COD Morza Północnego) i 62 IU / mg (Turcja insuliny i drobiu), przy czym aktywność insuliny ludzkiej jest rzędu 25-30 IU / mg [40]. Im większe różnice międzygatunkowe, tym większa różnica w aktywności biologicznej odpowiedniej insuliny.

Funkcjonalnie aktywna cząsteczka insuliny składa się z dwóch łańcuchów polipeptydowych (łańcuchy A i B) połączonych wiązaniami dwusiarczkowymi; jedno wiązanie jest utworzone przez siódmą resztę aminokwasową obu łańcuchów, drugie wiązanie dwusiarczkowe tworzy 20 reszta łańcucha A i 19 reszt łańcucha B (Figura 2). Ponadto w cząsteczce insuliny znajduje się trzecie wiązanie dwusiarczkowe, które jest wewnątrzłańcuchowe i łączy szóstą i jedenastą resztę łańcucha A [59,117].

Struktura drugorzędna Przy użyciu różnych właściwości fizyko-chemicznych i fizycznych metod wykazano, że cząsteczka insuliny jest wysoce charakterystyczne dla struktury trójwymiarowej (konformację), co przyczynia się do określonych funkcji biologicznych [14]. W cząsteczce natywnej insuliny zarówno cc-helisa jak i p-fold są obecne jednocześnie. Ponadto istnieją obszary o nieuporządkowanej strukturze i strukturze <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Po podgrzaniu, kwasowy roztwór insuliny (pH 2,3-2,5) w temperaturze 100 ° C i szybkie oziębienie do -80 ° C, tak zwanej insuliny włókniste - hormonu całkowicie nieaktywna postać [27]. Dodawanie włókien insuliny fibrylarne w aktywnym roztworze na insulinę powoduje spontaniczne wytrącenie ilościową insuliny w postaci włókienek [14,17].

Metody produkcji, standaryzacja i kontrola jakości preparatów insuliny

Pozyskiwanie zwierzęcych gatunków insuliny. Produkcja przemysłowa insuliny wołowej i wieprzowej została ustanowiona niemal równocześnie w wielu krajach, wkrótce po odkryciu insuliny w 1921 r. [63]. Od tego czasu koncepcja otrzymywania insuliny praktycznie nie uległa zmianie (tabela b) [17, 18]. Surowcami do produkcji zwierzęcych gatunków insuliny są trzustka bydła rzeźnego stosowanego do produkcji żywności.

Najważniejszym zadaniem w produkcji insuliny jest jego czyszczenie - uwalnianie substancji z towarzyszących zanieczyszczeń, które obniżają aktywność biologiczną, powodując reakcję immunologiczną lub potencjalnie niebezpieczne dla zdrowia pacjenta. Na przykład, po kilku latach użytkowania słabo oczyszczone insuliny we krwi pacjenta może wynosić do 5000 jednostek insuliny związany z przeciwciałami. Przeciwciała przeciwko insulinie znacząco wpływają na profil jej działania, a przez to przyczyniają się do nietrwałego przebiegu cukrzycy.

Pierwszą metodą oczyszczania insuliny była rekrystalizacja w obecności soli cynku. W 1945 r. Wykazano, że siedmiokrotna rekrystalizacja insuliny znacznie zmniejsza poziom reakcji alergicznych u pacjentów w porównaniu z oficjalnymi preparatami insuliny w tym czasie [63].

ekstrakcja przeciwprądowa (PE), chromatografia podziałowa (PX), chromatografia jonowymienna (COI) diskelek-troforeza (DEF) i chromatografię wykluczenia molekularnego (GEH) [63] z zastosowaniem liczby próbek insuliny metody niejednorodności po krystalizacji, a pojedynczy pokazuje krystalizacji.

Stwierdzono, że główne zanieczyszczenia są jednocześnie insulinę: proinsuliny, ich związków pośrednich, kowalencyjnych dimerów insuliny, monodezamidoinsulin i monoarginin monoetilinsulin, jak również szereg związków o wysokiej masie cząsteczkowej, nie są naturalne insuliny. Uogólnione wnioski z badań, z uwzględnieniem informacji o aktywności immunologicznej wykryciu zanieczyszczenia, [138], zakończenie jest potrzeba dodatkowego oczyszczania substancji insulinę tak, że metody analizy i DEF GEH wykryte jeden składnik - odpowiednie insuliny.

Aby rozwiązać problem oczyszczania insuliny w 1950 r., Zaproponowano metodę HEC, aw 1970 r. Metodę chromatografii anionowymiennej (AOX). Stwierdzono, że insulina, oczyszczona metodą AOX, zawiera około 500 ppm (części na milion) zanieczyszczeń z aktywnością proinsuliny [137]. Dodatkowe oczyszczanie insuliny za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej na odwróconych fazach (RP HPLC) zmniejsza zawartość frakcji immunogennych do granicy ich wykrycia [63].

Przegląd aktualnych osiągnięć w dziedzinie chromatograficznego oczyszczania insuliny przedstawiono w pracy [96]. Insulina, oczyszczona, sekwencyjnie, z użyciem IOC i GEC, nazywana jest insuliną jednoskładnikową [63]. Uzyskiwanie ludzkiej insuliny. Poszukiwanie metod uzyskiwania ludzkiej insuliny było spowodowane dwoma okolicznościami. Z jednej strony, znaczenie surowego problemu materiałów w przypadku produkcji insuliny zwierzęcej, z drugiej strony - szybki rozwój nauki w tej dziedzinie dał realną możliwość przedstawienia idei w praktyce. W 1979 i 1981 roku prawie równocześnie opracowano dwie metody otrzymywania ludzkiej insuliny - biosyntetyczną i półsyntetyczną [102, 108]. W 1981 roku firma Novo Nordisk po raz pierwszy na świecie rozpoczęła seryjną produkcję ludzkiej półsyntetycznej insuliny. Metoda stosowana przez firmę opiera się na enzymatycznej i chemicznej zamianie Al w cząsteczce insuliny świńskiej z resztą Tre [61]. Ta metoda jest bezpośrednio zależna od uzyskania wymaganej ilości insuliny świńskiej, co zmniejsza jej wartość ekonomiczną. Możliwość uzyskania ludzkiej insuliny metodą biosyntetyczną pojawiła się wraz z rozwojem technologii rekombinacji DNA [10]. Prace nad genetycznie zmodyfikowaną insuliną rozpoczęły się około 25 lat temu. W 1978 r. Stwierdzono, że otrzymano szczep proinsou-ling u szczurów E. coli. W 1979 roku badania Genentecha pozwoliły klonować do E. coli geny kodujące sekwencje aminokwasów. łańcuchów A i B insuliny w galoktozidazny plazmidu p-vklyuchennmi pBR322 porcji [10,102]. W 1981 zsyntetyzowano genu analogu proinsuliny - mini-proinsuliny-C, przy czym 35 wrzodziejące segmentu C-peptydu otrzymuje sześć aminokwasów: Arg-Arg-Gly-Ser-Lys-Arg i przedstawia jej ekspresję w E. coli. W 1982 r. Firma Eli Lilly rozpoczęła pierwszą na świecie przemysłową produkcję insuliny ludzkiej, stosując dwie technologie łańcuchowe opracowane we współpracy z Genentech [102]. Obecnie pokazano możliwość uzyskania ludzkiej insuliny za pomocą różnych układów ekspresyjnych [3,10,101,102]. Z ekonomicznego punktu widzenia istotne znaczenie ma zastosowanie genetycznie zmodyfikowanych szczepów E. coli, bakterii Gram-dodatnich bakterii, z których wiele jest rozpatrywanych superproducer [3]. Jednocześnie osiągnięto znaczny postęp w przypadku komórek drożdży Saccharomices cerevisiae [3,75]. Tabela 7 wymienia główne, wspólne dla różnych metod wytwarzania rekombinowanej insuliny ludzkiej, etapy procesu technologicznego [3,10,63].

Zastosowanie opracowanej metodologii do testowania oficjalnych preparatów insuliny

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) - wariant chromatografii cieczowej na kolumnie, przy czym faza ruchoma - eluent: - wypełnienie kolumny przechodzi przez sorbent z dużą prędkością w wyniku znacznym ciśnieniem (400h105 Pa) na wlocie do kolumny [11].

Jako sposób analizy złożonych mieszanin substancji, HPLC pojawiła się nieco ponad 30 lat temu. Zastosowanie sorbentów o średnicy cząstek 3-10 μm spowodowało gwałtowny wzrost wydajności rozdziału chromatograficznego w porównaniu z klasyczną wersją chromatografii kolumnowej. Dlatego też HPLC jest często określana jako wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC). Cechy instrumentalne stosowania HPLC opisano szczegółowo w licznych podręcznikach [49.50] oraz w odpowiednich sekcjach wiodącej farmakopei [79,150]. W przypadku HPLC opracowano i produkuje się szeroki zakres sorbentów. Według autorów sondażu [51] - około 100 firm na całym świecie produkuje ponad 300 rodzajów nazw sorbentów. Historia, stan obecny i perspektywy rozwoju metody omówiono w opiniach [51] i [77,78].

W różnych wariantach metoda HPLC jest szeroko stosowana w analizie farmaceutycznej (kontrola produkcji i testowanie jakości leku). Metoda znajduje się we wszystkich wiodących farmakopeach świata. Ta metoda jest najdokładniej opisana w Farmakopei Europejskiej i Amerykańskiej. HPLC służy do identyfikacji leków, w celu określenia czystości, składu cząstkowego masy cząsteczkowej i analizy ilościowej. W publikacji US Pharmacopoeia 28 ed. około 30% artykułów prywatnych wymaga użycia HPLC. W European Pharmacopoeia wyd. liczba ta wynosi około 40%.

Pierwszą chromatograficzną metodą testowania insuliny była niskociśnieniowa chromatografia cieczowa wykluczająca żel (GE ZhND). Zasada rozdziału w warunkach HPLC opiera się na różnej zdolności cząsteczek różnej wielkości do penetracji porów neutralnego żelu, który służy jako faza stacjonarna. Średnica hydrodynamiczna monomeru i dimeru insuliny jest proporcjonalna do ich masy cząsteczkowej i wynosi odpowiednio 2,69 i 5,50 nm [115].

W 1967 roku, stosując metodę GE-IHDD, wykazano, że dostępne w handlu preparaty insuliny, oczyszczone przez krystalizację, zawierają zanieczyszczenia o masie cząsteczkowej przekraczającej masę cząsteczkową insuliny [63]. Na chromatogramach świńskiej insuliny znaleziono trzy piki, konwencjonalnie oznaczone jako składniki a-, b- i c. Od tego czasu zaproponowano wiele systemów chromatograficznych do kontrolowania zawartości zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej w preparatach insuliny. Rozdzielanie prowadzi się w silnie pęczniejącego kserożele agarozy (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.), Lub dekstran (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals) użyto jako rozwiązania PD 1-3 M kwasu octowego, [127]. Wysoka czułość tych sorbentów na ściskanie przy ciśnieniach przekraczających ciśnienie pęcznienia matrycy powoduje, że te materiały nie nadają się do pracy w trybie HPLC.

Zastosowanie chromatografii cieczowej wykluczającej żel pod wysokim ciśnieniem (GE HPLC) do analizy insuliny zostało po raz pierwszy opisane w 1980 r., Po opracowaniu twardych makroporowatych sorbentów zgodnych z wodą i wytrzymujących wysokie ciśnienia. W [151] Rozdzielenie prowadzono w kolumnie Protein 1-125-Pak (Waters), żelowych TSK SW 2000 (Toho sodowy Corp.), Bondagel (Pharmacia) w warunkach denaturujących (7 M mocznik mieszaninie roztworu kwasów mineralnych lub jon detergenty). Konieczność analizy insuliny w warunkach denaturujących wiąże się ze zdolnością insuliny do agregacji w roztworze. Do rozdziału insuliny w warunkach HPLC HPLC opisano również zastosowanie "tradycyjnego" eluentu kwasu octowego [152]. Zastosowanie kwasu octowego ma kilka zalet - minimalny wpływ na natywną strukturę wydzielonych związków, dostępność, niski koszt, ponadto ważnym faktem jest zdolność kwasu octowego do tłumienia asocjacji insuliny.

Obecnie GE HPLC jest farmakopealną metodą monitorowania zawartości zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej w substancjach i gotowych postaciach dawkowania. Metoda służy również do oznaczania zawartości protaminy w preparatach izofanowo-insuliny.

Zastosowanie HPLC na odwróconych fazach (RP HPLC) do oddzielania bydła i świńskiej insuliny po raz pierwszy wykazało wysoką skuteczność tej metody do analizy insulinopodobnych peptydów o podobnej strukturze.

Mechanizm rozdziału białek i polipeptydów w warunkach RP HPLC opiera się na różnej hydrofobowości cząsteczek insuliny i powiązanych zanieczyszczeń. Dotychczas opisano kilkadziesiąt metod chromatograficznego rozdzielania insuliny różnego pochodzenia i ich pochodnych, w tym proinsulin, polipeptydów trzustkowych, pochodnych dezamido, dimeru insuliny. [126] wykazali możliwość oddzielania insuliny z kurczaka, królika, owiec i konia. Oddzielono także insulinę ludzką, wołową i wieprzową. Lloyd i Corran opublikowali metodę oddzielania wołowiny, wieprzowiny, ludzkich insuliny i ich odpowiednich deamidowanych form [104].

Rozdzielanie przeprowadza się na modyfikowanych sorbentach na żelu krzemionkowym, grupach metylowych, butylowych, oktylowych, oktadecylowych i fenylowych w trybie izokratycznym lub gradientowym. Jako PF stosuje się modyfikatory organiczne - acetonitryl, alkohol metylowy, alkohol izopropylowy, zmieszane z wodnymi roztworami buforowymi zawierającymi sole nieorganiczne i odczynniki na bazie jonów. Wykrywanie pików odbywa się głównie metodą spektrofotometryczną przy długości fali 190-220 nm, opisano także metody fluorymetryczne [103].

Analiza substancji i gotowych postaci dawkowania insuliny za pomocą RP HPLC została opisana w prywatnych artykułach w Farmakopei Amerykańskiej i Europejskiej [79, 150]. Metoda służy do testowania leków z określonej grupy pod względem "Autentyczności insuliny", "Pokrewnych białek", "Oznaczenia ilościowego" i "Insuliny w roztworze".

Literatura badawcza opisuje również zastosowanie chromatografii jonowymiennej i powinowactwa do analizy insuliny [44, 102], jednak metody te nie były szeroko stosowane w praktyce farmakopealnej.

Wybór warunków chromatograficznego oznaczania protaminy w postaciach dawek insuliny izofanowej

Zwiększone siły jonowej PF zazwyczaj prowadzi do zwiększenia zdolności insuliny współczynniki, które mogą być spowodowane przez szereg czynników: - zwiększenie stężenia jonów zmniejsza stopień jonizacji naładowanych grup na cząsteczkę białka, zwiększenie jego hydrofobowości / - wysokie stężenie kationów przyczynia ekranowania wolnych grup silanolowych na powierzchni stacjonarnej faza, która osłabia niespecyficzne oddziaływanie elektrostatyczne protonowanych grup aminowych białka z matrycą; - wysoka siła jonowa wpływa na przestrzenną strukturę insuliny, w wyniku czego zmienia się powierzchnia dostępna dla interakcji z sorbentem. Stężenie soli nieorganicznych w FS wpływa na kształt pików i selektywność rozdziału insuliny i insuliny desamido-Asn [143, 144]. Podczas elucji izokratycznej za pomocą sorbentu LiChrosorb Sіv 0,1 M roztwór fosforanu sodu (pH 2,3), zadowalający wynik został osiągnięty tylko przez dodanie siarczanu sodu w roztworze buforowym do uzyskania stężenia 0,1 M. Większość technik analizy insuliny zawiera w farmakopei monografiach, a ND stosować PF na bazie roztworów buforowych o zawartości siarczanu sodu równej 0,2 M. Tak wysoka zawartość siarczanu sodu negatywnie wpływa na powtarzalność wyników chromatografii z powodu stratyfikacji eluentów, ponadto Silnie stężone roztwory soli mają negatywny wpływ na sprzęt chromatograficzny, skracając jego żywotność. Biorąc pod uwagę, że farmakopealne metody analizy opracowano ponad 20 lat temu, interesujące wydaje się zbadanie zachowania chromatograficznego insuliny pod OF-HPLC na chromatograficznych sorbentach najnowszej generacji, w zależności od stężenia siarczanu sodu. Jednocześnie próbowali ustalić, czy redukcja zawartości siarczanu sodu w PF jest dopuszczalna bez znacznego pogorszenia zdolności separacji układu chromatograficznego. W wyniku badań stwierdzono, że wpływ stężenia siarczanu sodu w PF jest różny, w zależności od rodzaju przeszczepionej fazy, a także od gatunku insuliny. Na sorbentach ze szczepionymi grupami C4 i C selektywność oddzielania pików insuliny ludzkiej i insuliny desamido-Asn-ludzki nie zależy od stężenia siarczanu sodu w. roztwór buforowy 1 w zakresie od 0,05 M do 0,2 M. Na sorbencie Diaspher-110-C18 selektywność rozdzielania tej pary pików wynosi maksymalnie 0,05 M, a minimalna 0,1 M (wykres 4). Z drugiej strony, selektywność oddzielania gatunków zwierzęcych insuliny i odpowiadających im desamidowanych postaci AsnA21 nie zależy od siły jonowej roztworu, gdy jest on rozdzielany na sorbencie Diaspher-110-C18. Na sorbencie z grupami szczepionymi C8 selektywność wzrasta od 1,25 do 1,28 przy wzroście stężenia siarczanu sodu (figura 4). Na sorbentu szczepionych grup selektywność rozdzielania C4 w przypadku insuliny wołowej maksymalnej, gdy zostanie wykryta: 0,1 M siarczanu sodu, a minimalne 0,2 M. W przypadku insuliny świńskiej wyraźne maksimum przy stężeniu 0,1 M siarczanu sodu, w tym przypadku zwiększenie jonowe siły doprowadziły do zmniejszenia selektywności separacji (rysunek 4). Liczba skutecznych półek teoretycznych wzrasta wraz ze wzrostem stężenia siarczanu sodu. Wyjątek stanowi zachowanie ludzkiej insuliny na sorbencie Diasfer-110-C8 (rysunek 5). Stopień separacji szczytów insuliny i insuliny desamido-Asn wzrasta wraz ze wzrostem siły jonowej FS, niezależnie od gatunku insuliny i typu fazy szczepionej (schemat b). Zmniejszając stężenie siarczanu sodu z 0,2 M do 0,1 M, stopień separacji wybranej pary szczytów zmniejsza się średnio o 5% dla insuliny ludzkiej i świńskiej oraz o 10% dla insuliny wołowej. Biorąc pod uwagę fakt, że bezwzględna wartość stopnia rozdziału przekracza 2,0, zmierzone pogorszenie zdolności separacji kolumny, naszym zdaniem, nie jest znaczące. W konsekwencji stężenie siarczanu sodu w roztworze buforowym PF można zmniejszyć o 2 razy w porównaniu z farmakopelowymi metodami analizy.

W większości badań nad analizą białek i peptydów rozdział prowadzono w temperaturze pokojowej. Co więcej, niektórzy autorzy wskazują, że wpływ temperatury na selektywność separacji jest minimalny [48]. Jednak wraz ze wzrostem temperatury proces wymiany masy pomiędzy fazą stacjonarną i ruchomą zostaje przyspieszony, co prowadzi do skrócenia czasu retencji peptydów i zwężenia pików.

Technologia insulinowa

Naruszenie wydzielania insuliny. Wykorzystanie fotografii partnerskiej. Schemat dla insuliny. Ekspresja proinsuliny w komórkach E. coli. Podejścia do rozwiązania problemu cukrzycy. Wkład biotechnologii w przemysłową produkcję hormonów niepeptydowych.

Wysyłanie dobrej pracy w bazie wiedzy jest proste. Skorzystaj z poniższego formularza.

Studenci, absolwenci, młodzi naukowcy, którzy korzystają z bazy wiedzy w swoich badaniach i pracy będą Ci bardzo wdzięczni.

Wysłany http://www.allbest.ru/

MINISTERSTWO EDUKACJI I NAUKI REPUBLIKI KAZACHSTANU

KAZAKH AGRO-TECHNICAL UNIVERSITY NAMED AFTER S.SEYFULLIN

Katedra Mikrobiologii i Biotechnologii

W dyscyplinie "Biotechnologia mokroorganizmov"

Na temat: technologia insuliny

Ukończone: Myrzabek M? Ldir Kurbanbek? Yzy

Sprawdzono: Akimbaeva A.K. (k. B. N.)

SKRÓTY I SYMBOLE

1. Historia odkrycia

2. Pobieranie insuliny w biotechnologii

3. Sposoby pozyskiwania ludzkiej insuliny

4. Ekspresja proinsuliny w komórkach E. coli

5. Oczyszczanie insuliny

6. Dawkowanie i sposób podawania

W tym kursie wykorzystano następujące definicje:

Białkowy nośnik - zapewniający transport białka hybrydowego w periplazmatycznej przestrzeni komórki lub pożywki hodowlanej;

Składnik powinowactwa - znacznie ułatwia selekcję białka hybrydowego.

Insulina (z łaciny, Insula - wyspa) - hormon peptydowy, powstaje w komórkach beta wysepek Langerhansa trzustki.

Interleukiny to grupa cytokin syntetyzowanych głównie przez leukocyty (z tego powodu wybrano zakończenie "-leukiny").

Proinsulina jest prekursorem insuliny syntetyzowanej przez komórki B wyspiarskiego aparatu trzustki.

Chromatografia (z greckiego: Chroma, chromatos - kolor, farba), fizyko-chemiczna metoda rozdziału i analizy mieszanin, oparta na rozkładzie ich składników między dwiema fazami - stacjonarna i ruchoma (eluent), przepływająca przez nieruchomy.

Enkapsulacja - mechanizm języka programowania, który ogranicza dostęp do komponentów składających się na obiekt (metody i właściwości), czyni je prywatnymi, to znaczy dostępnymi tylko wewnątrz obiektu.

Białko fuzyjne (białko fuzyjne, również białko chimeryczne) jest białkiem uzyskanym przez połączenie dwóch lub więcej genów, które pierwotnie kodowały oddzielne białka.

Hormony (z języka greckiego, Hormao - wprowadzają w ruch, indukują), hormony, substancje biologicznie czynne wytwarzane przez gruczoły dokrewne lub gruczoły wydzielania wewnętrznego i wydzielane przez nie bezpośrednio do krwi.

Cukrzyca to grupa chorób endokrynologicznych, rozwijająca się w wyniku bezwzględnej lub względnej niewydolności hormonu insuliny.

Somatostatyna jest hormonem komórek delta trzustkowych wysepek Langerhansa, a także jednym z hormonów podwzgórza.

Analiza radioimmunologiczna jest metodą ilościowego oznaczania substancji biologicznie czynnych (hormonów, enzymów, leków itp.) W płynach biologicznych, w oparciu o konkurencyjne wiązanie pożądanych substancji stabilnych i podobnych do nich znakowanych radionuklidem ze specyficznymi systemami wiązania.

SKRÓTY I SYMBOLE

HPLC - wysokosprawna chromatografia cieczowa

cDNA - komplementarny kwas dezoksyrybonukleinowy

Główną funkcją insuliny jest zapewnienie przepuszczalności błon komórkowych dla cząsteczek glukozy. W uproszczonej formie można powiedzieć, że ostatecznie nie tylko węglowodany, ale także wszelkie składniki odżywcze zostają podzielone na glukozę, która służy do syntezy innych cząsteczek zawierających węgiel i jest jedynym rodzajem paliwa dla elektrowni komórkowych - mitochondriów. Bez insuliny przepuszczalność błony komórkowej do glukozy spada 20-krotnie, a komórki umierają z głodu, a nadmiar cukru rozpuszczony we krwi zatruwa organizm.

Niedobór insuliny spowodowany zniszczeniem komórek beta - bezwzględny niedobór insuliny - jest kluczowym elementem w patogenezie cukrzycy typu 1. Naruszenie wpływu insuliny na tkankę - względny niedobór insuliny - ma ważne miejsce w rozwoju cukrzycy typu 2.

Zastosowanie chromatografii powinowactwa znacznie zmniejszyło zawartość zanieczyszczających białek w preparacie o wyższej masie cząsteczkowej niż insulina. Takie białka obejmują proinsulinę i częściowo rozszczepione proinsuliny, które są zdolne do indukowania wytwarzania przeciwciał antyinsulinowych.

Stosowanie insuliny ludzkiej od samego początku terapii minimalizuje występowanie reakcji alergicznych. Insulina ludzka jest wchłaniana szybciej i, niezależnie od postaci leku, ma krótszy czas działania niż insulina zwierzęca. Insuliny ludzkie mają mniej immunogenów niż wieprzowina, zwłaszcza mieszane insuliny bydlęce i świńskie.

Celem tego kursu jest zbadanie technologii insuliny. Aby osiągnąć następujące cele zostały ustalone:

1. uzyskanie insuliny w biotechnologii

2. Sposoby na uzyskanie insuliny

H. Oczyszczanie insuliny

Historia odkrycia insuliny związana jest z nazwiskiem rosyjskiego lekarza I.M. Sobolewa (druga połowa XIX wieku), który udowodnił, że poziom cukru we krwi ludzkiej jest regulowany przez specjalny hormon trzustki.

W 1922 r. Insulinę wyizolowaną z trzustki zwierzęcia wprowadzono po raz pierwszy do dziesięcioletniego chłopca, pacjent z cukrzycą przekroczył wszelkie oczekiwania, a rok później amerykańska firma Eli Lilly wydała pierwszy preparat insuliny zwierzęcej.

Po otrzymaniu pierwszej przemysłowej partii insuliny w ciągu następnych kilku lat przeprowadzono ogromny proces jej izolacji i oczyszczenia. W rezultacie hormon stał się dostępny dla pacjentów z cukrzycą typu 1.

W 1935 roku duński naukowiec Hagedorn zoptymalizował działanie insuliny w organizmie, proponując przedłużone leczenie.

Pierwsze kryształy insuliny otrzymano w 1952 r., Aw 1954 r. Angielski biochemik G. Senger odcyfrował strukturę insuliny. Opracowanie metod oczyszczania hormonu z innych substancji hormonalnych i produktów degradacji insuliny umożliwiło uzyskanie jednorodnej insuliny, zwanej insuliną jednoskładnikową.

Na początku lat 70. Radzieccy naukowcy A. Yudaev i S. Shvachkin zaproponowali syntezę chemiczną insuliny, jednak wdrożenie tej syntezy na skalę przemysłową było kosztowne i nieopłacalne.

W przyszłości obserwowano stopniową poprawę stopnia oczyszczenia insulin, co zmniejszyło problemy spowodowane przez alergie na insulinę, upośledzenie czynności nerek, zaburzenia widzenia i odporność na insulinę. Najbardziej skuteczny hormon był potrzebny do terapii substytucyjnej w cukrzycy - homologicznej insulinie, czyli ludzkiej insulinie.

W latach 80. postępy w dziedzinie biologii molekularnej umożliwiły syntezę obu łańcuchów insuliny ludzkiej za pomocą E.coli, które następnie połączono w biologicznie aktywną cząsteczkę hormonalną, a rekombinowaną insulinę otrzymano w Instytucie Chemii Bioorganicznej Rosyjskiej Akademii Nauk, stosując szczepy genetyczne E. coli.

2. Pobieranie insuliny w biotechnologii

Insulina, hormon peptydowy wysp trzustkowych Langerhansa, jest główną metodą leczenia cukrzycy. Choroba ta jest spowodowana niedoborem insuliny i objawia się wzrostem poziomu glukozy we krwi. Do niedawna insulinę pozyskiwano z trzustki byka i świni. Lek różnił się od substytucji ludzkiej insuliny 1-3 aminokwasami, tak więc istniało zagrożenie reakcji alergicznych, zwłaszcza u dzieci. Terapia insulinowa na szeroką skalę była ograniczona ze względu na wysokie koszty i ograniczone zasoby. Przez modyfikację chemiczną insulina ze zwierząt była nieodróżnialna od człowieka, ale oznaczało to dodatkowy wzrost kosztów produktu. [1]

Od 1982 r. Eli Lilly produkuje insulinę modyfikowaną genetycznie w oparciu o oddzielną syntezę E. coli - i łańcuchów B. Koszt produktu znacznie się zmniejszył, wytwarzana insulina jest identyczna jak u człowieka. Od 1980 roku w prasie pojawiły się doniesienia o klonowaniu genu proinsuliny, prekursora hormonu, który przechodzi w dojrzałą postać o ograniczonej proteolizie.

Technologia enkapsulacji jest również związana z leczeniem cukrzycy: komórki trzustki w kapsułce, wprowadzone raz do ciała pacjenta, produkują insulinę w ciągu roku.

Integrated Genetics uruchomił produkcję hormonów stymulujących pęcherzyki i luteinizujących. Peptydy te składają się z dwóch podjednostek. W programie jest kwestia przemysłowej syntezy hormonów oligopeptydowych układu nerwowego, ankefalin, zbudowanych z 5 reszt aminokwasowych i endorfin, analogów morfiny. Dzięki racjonalnemu stosowaniu tych peptydów złagodzić ból, stworzyć dobry nastrój, zwiększyć wydajność, skoncentrować uwagę, poprawić pamięć, uporządkować sen i czuwanie. Przykładem udanego zastosowania metod inżynierii genetycznej jest synteza β-endorfiny przy użyciu opisanej powyżej technologii białka hybrydowego dla innego hormonu peptydowego, somatostatyny [2].

3. Sposoby pozyskiwania ludzkiej insuliny

Historycznie pierwszym sposobem uzyskania insuliny do celów terapeutycznych jest izolacja analogów tego hormonu z naturalnych źródeł (trzustkowe wysepki bydła i trzody chlewnej). W latach dwudziestych ubiegłego wieku odkryto, że insulina bydlęca i świńska (znajdujące się najbliżej ludzkiej insuliny w strukturze i sekwencji aminokwasów) wykazują aktywność w ciele ludzkim porównywalną do ludzkiej insuliny. Następnie insulinę bydlęcą lub świńska stosowano przez długi czas w leczeniu pacjentów z cukrzycą typu 1. Jednak po pewnym czasie wykazano, że w niektórych przypadkach przeciwciała przeciwko bydlęcej i świńskiej insuliny zaczynają gromadzić się w organizmie człowieka, tym samym niwecząc ich działanie.

Z drugiej strony, jedną z zalet tej metody otrzymywania insuliny jest dostępność surowców (insulina bydlęca i świńska może być łatwo uzyskana w dużych ilościach), co odegrało decydującą rolę w opracowaniu pierwszej metody otrzymywania ludzkiej insuliny. Metoda ta jest nazywana półsyntetyczną [3].

W tym sposobie wytwarzania ludzkiej insuliny jako surowca stosowano świńska insulinę. Oczyszczoną insulinę świńskiej trawiono C-końcowym oktapeptydem łańcucha B, po czym zsyntetyzowano C-końcowy oktapeptyd ludzkiej insuliny. Następnie był on chemicznie związany, grupy ochronne zostały usunięte, a otrzymana insulina została oczyszczona. Podczas badania tej metody otrzymywania insuliny wykazano całkowitą identyczność hormonu uzyskanego z insuliną ludzką. Główną wadą tej metody jest wysoki koszt powstałej insuliny (nawet teraz synteza chemiczna oktapeptydu jest kosztowna, zwłaszcza na skalę przemysłową).

Obecnie insulinę ludzką uzyskuje się głównie dwojako: modyfikując insulinę wieprzową metodą syntetyczno-enzymatyczną i metodą inżynierii genetycznej.

W pierwszym przypadku metoda opiera się na fakcie, że świńska insulina różni się od insuliny ludzkiej pojedynczym podstawieniem na C-końcu łańcucha B Ala30Thr. Zastąpienie alaniny treoniną prowadzi się za pomocą katalizowanego enzymatycznie cięcia alaniny i zamiast tego dołącza się resztę treoniny zabezpieczoną grupą karboksylową obecną w mieszaninie reakcyjnej w dużym nadmiarze. Po odszczepieniu ochronnej grupy O-tert-butylu otrzymuje się ludzką insulinę. (zdjęcie 1)

Rysunek 1 - Schemat metod wytwarzania ludzkiej insuliny

Insulina była pierwszym białkiem otrzymanym do celów komercyjnych z wykorzystaniem technologii rekombinacji DNA. Istnieją dwa główne podejścia do uzyskania genetycznie modyfikowanej ludzkiej insuliny. W pierwszym przypadku oddzielne (różne szczepy producentów) wytwarzają oba łańcuchy, a następnie fałdowanie cząsteczki (tworzenie mostków dwusiarczkowych) i rozdzielanie misoform. W drugim preparacie w postaci prekursora (proinsuliny), a następnie enzymatycznego rozszczepienia trypsyną i karboksypeptydazą. W aktywnej formie hormonu. Obecnie najkorzystniejsze jest wytwarzanie insuliny jako prekursora, zapewniającej prawidłowe zamknięcie mostków dwusiarczkowych (w przypadku oddzielnej produkcji łańcuchów, kolejnych cykli denaturacji, separacji misoform i renaturacji [3].

W obu podejściach możliwe jest zarówno indywidualne uzyskiwanie wyjściowych składników (łańcuchy A i B lub proinsulina), jak i jako część białek hybrydowych. Oprócz łańcuchów A i B lub proinsuliny może być obecny w składzie białek hybrydowych:

1) białko nośnikowe - zapewniające transport białka hybrydowego do przestrzeni periplazmatycznej komórki lub pożywki hodowlanej;

2) składnik powinowactwa - znacznie ułatwia selekcję białka hybrydowego.

Jednocześnie oba te składniki mogą jednocześnie występować w składzie białka hybrydowego. Ponadto, podczas tworzenia białek hybrydowych można zastosować zasadę wielowymiarowości (to znaczy, że kilka kopii docelowego polipeptydu jest obecnych w białku hybrydowym), co umożliwia znaczne zwiększenie wydajności docelowego produktu [4].

Użyliśmy szczepu JM 109 N1864 z sekwencją nukleotydową osadzoną w plazmidzie eksprymującym białko hybrydowe, które składa się z liniowej proinsuliny i fragmentu fragmentu białka Astaphylococcusaureus przyłączonego do N-końca przez resztę metioniny. Hodowla nasyconej biomasy komórek rekombinowanego szczepu zapewnia początek produkcji białka hybrydowego, którego izolacja i sekwencyjne przekształcenie przez intubację prowadzi do insuliny. Inna grupa badaczy otrzymała w bakteryjnym układzie ekspresyjnym rekombinowane białko fuzyjne, składające się z ludzkiej proinsuliny i ogona polihistydynowego przyłączonego do niego przez resztę metioniny. Wyodrębniono go za pomocą chromatografii chelatowej na kolumnach Ni-agaroza z ciałek inkluzyjnych i strawiono bromocyjanem. Autorzy stwierdzili, że wyizolowane białko jest S-siarkowane. Analiza mapowania i spektrometrii mas uzyskanej proinsuliny, oczyszczona za pomocą chromatografii jonowymiennej na wymieniaczu anionowym i RP (odwrócona faza) HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa), wykazała obecność mostków dwusiarczkowych odpowiadających dwusiarczkowym mostom natywnej ludzkiej proinsuliny. Podano również informacje o opracowaniu nowej, ulepszonej metody otrzymywania insuliny ludzkiej metodami inżynierii genetycznej w komórkach prokariotycznych. Autorzy stwierdzili, że insulina otrzymana w jej strukturze i aktywności biologicznej jest identyczna z hormonem wyizolowanym z trzustki [5].

Ostatnio zwrócono szczególną uwagę na uproszczenie procedury wytwarzania rekombinowanej insuliny metodami inżynierii genetycznej. Tak więc, białko fuzyjne składające się z peptydu liderowego interleukiny dołączonego do końca N proinsuliny otrzymano przez resztę lizyny. Białko było wydajnie eksprymowane i umiejscowione w ciałkach inkluzyjnych. Po izolacji białko zostało pocięte trypsyną w celu wytworzenia insuliny i peptydu C. Inna grupa badaczy działała w podobny sposób. Białko fuzyjne składające się z proinsuliny i dwóch syntetycznych domen białka A Staphylococcus, które wiążą IgG, było umiejscowione w ciałkach inkluzyjnych, ale miało wyższy poziom ekspresji. Białko wyizolowano za pomocą chromatografii powinowactwa z użyciem IgG i potraktowano trypsyną i karboksypeptydazą B. Otrzymaną insulinę i peptyd C oczyszczono metodą RP-HPLC. Podczas tworzenia struktur fuzyjnych stosunek masy białka nośnikowego do docelowego polipeptydu jest bardzo znaczący. W ten sposób opisano konstrukcję konstruktów fuzyjnych, w których jako polipeptyd nośnikowy zastosowano białko, które wiąże albuminy surowicy ludzkiej. Dołączono do niej jeden, trzy i siedem peptydów C. Peptydy C połączono na zasadzie "głowa-ogon" przy użyciu przekładek aminokwasowych niosących miejsce restrykcyjne Sfi I i dwie reszty argininy na początku i na końcu sekwencji rozdzielającej w celu dalszego rozszczepienia białka trypsyną. Produkty do rozszczepiania metodą HPLC wykazały, że peptyd C jest odcinany ilościowo, co pozwala na zastosowanie metody syntetycznych genów multimerycznych do produkcji docelowych polipeptydów na skalę przemysłową.

Uzyskanie zmutowanej proinsuliny, która zawierała zastąpienie Arg32Tyr. W wyniku połączenia tego białka z trypsyną i karboksypeptydazą B powstały natywne insuliny i peptyd C zawierający resztę tyrozyny. Ta ostatnia, po znakowaniu 125I, jest aktywnie wykorzystywana w teście radioimmunologicznym [6].

Kontrola jakości insuliny

Treść

1. Ogólne informacje na temat otrzymywania insuliny 5

2. Metody stosowane do kontroli jakości insuliny 8

Piśmiennictwo 17

Fragment z pracy

1-2% populacji europejskiej cierpi na cukrzycę, a około 20% tych pacjentów nie może istnieć bez zastrzyków insuliny. Od czasu pierwszych eksperymentów dotyczących stosowania insuliny w leczeniu cukrzycy w 1922 r. Hormon ten wyizolowano z trzustki zwierząt (krów i świń). Insulina zwierzęca różni się nieznacznie w sekwencji aminokwasowej od ludzkiej insuliny.

Insulina ludzka i świńska są szczególnie bliskie: w insulinie trzustkowej C-terminalna treonina łańcucha B zastępowana jest alaniną. Krów i insuliny ludzkiej różnią się trzema resztami aminokwasowymi. To właśnie te różnice określały zwiększoną aktywność immunogenną insuliny bydlęcej w porównaniu z insuliną trzustkową.

Prawie wszyscy pacjenci leczeni insuliną krowie mieli przeciwciała przeciwko insulinie we krwi. Właściwości antygenowe insuliny zostały również częściowo określone przez zanieczyszczenia w jej preparatach. Najprawdopodobniej to tworzenie przeciwciał przeciw insulinie wyjaśniło pewne niewielkie skutki uboczne podczas wstrzykiwania insuliny krowie, na przykład atrofię tłuszczu podskórnego w miejscu ponownego wstrzyknięcia. W przypadku wysoce oczyszczonej insuliny efekty te były nieobecne.

Następnie, dzięki inżynierii genetycznej i użyciu E. coli, uzyskano ludzką insulinę.

Insulina ludzka, otrzymana przez E. coli, była pierwszym "genetycznie modyfikowanym" białkiem testowanym na ludziach. W doświadczeniach ze zdrowymi ochotnikami stwierdzono, że jest bezpieczny (nie powoduje reakcji alergicznych i innych niepożądanych reakcji) i ma zdolność obniżania poziomu glukozy we krwi przy podawaniu podskórnym lub dożylnym.

Obecnie taka ludzka insulina jest uzyskiwana przez wielu diabetyków na całym świecie. Było to poprzedzone badaniami klinicznymi, w których badano zmiany metaboliczne i efekty immunologiczne.

Znaczenie naszego tematu jest takie, że niekontrolowana lub źle kontrolowana produkcja może prowadzić do uwolnienia skażonych preparatów insuliny, co z kolei może prowadzić do niepożądanych konsekwencji klinicznych.

Celem tej pracy jest zbadanie metod stosowanych w kontroli jakości insuliny.

Referencje

GOST R 52249-2004 "Zasady produkcji i kontroli jakości leków" 2004

OFS 42-0002-00 "Endotoksyny bakteryjne" 2000

OFS 42-0126-09 "Biologiczne testowanie insuliny"

Artykuł farmakopealny Federacji Rosyjskiej FS 42-2620-97. 1997

Bairamashvili D.I. Inżynieria genetyczna insuliny ludzkiej: sukcesy i perspektywy // Rosyjski dziennik chemiczny. - 2005 r. - T. XLIX. - № 1. - str. 34-45.

Goncharenko G.G. Podstawy biotechnologii: metoda nauczania. kompleks dla stud.biolog. specjalne / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min arr. RB. - Gomel: EI "GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 pkt.

Ryabko, Yu.S., Lukin, OV, Shepel, E.N. Zastosowanie metody kinetyczno-chromogennej do oznaczania endotoksyny bakteryjnej (test LAL) w technologii oczyszczania genetycznie modyfikowanej ludzkiej insuliny // Biopharmaceutical journal - 2009. - Vol. 1. - №1. - str. 34-37.