Oznaczanie glukozy metodą oksydazy glukozowej

Analizy

Określanie stężenia glukozy we krwi jest jednym z najczęściej wykonywanych badań biochemicznych w laboratoriach.

Metoda oksydazy glukozowej do oznaczania glukozy we krwi i moczu opiera się na reakcji utleniania glukozy w obecności enzymu oksydazy glukozy z tworzeniem się nadtlenku wodoru, który z kolei w obecności peroksydazy utlenia ortotolidynę, tworząc barwne produkty; o Stężenie glukozy jest obiecane ilością kolorowych produktów.

Ponieważ metoda oksydazy glukozy ma na celu identyfikację glukozy, a nie wszystkich rodzajów cukrów, jest stosowana w diagnostyce różnicowej następujących chorób:

Zasada metody oksydazy glukozy do oznaczania glukozy

Glukoza w obecności enzymu oksydazy glukozy utlenia się pod wpływem tlenu atmosferycznego, tworząc nadtlenek wodoru podczas reakcji. Nadtlenek wodoru w obecności enzymu peroksydazy utlenia orthotoluidynę, tworząc barwny związek, którego intensywność koloru jest proporcjonalna do zawartości glukozy. Ta metoda pozwala określić poziom glukozy w osoczu krwi, surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym.

Normalny poziom glukozy we krwi, mmol / l

- w osoczu, w natsheartse

noworodki - 1,7 - 4,2
dzieci w wieku od 6 tygodni do 15 lat - 3,3 - 5,4
dorośli (mężczyźni, kobiety) - 3,9 - 5,6

- w surowicy, w natsheartse

noworodki - 2,6 - 4,2
dzieci w wieku od 6 tygodni do 2 lat - 3,3 - 5,4
dorośli (mężczyźni, kobiety) - 3,9 - 5,6

Niezbędne odczynniki do oznaczania glukozy metodą oksydazy glukozowej

1. Chlorek sodu 9 gramów / litr (roztwór izotoniczny): wytworzony przez rozpuszczenie 0,9 g NaCl w 100 ml wody.

2. Siarczan cynku, 50 g / l: 5 g siarczanu cynku (ZnSO4) rozpuszcza się w wodzie, objętość doprowadza się do 100 ml.

3. Wodorotlenek sodu, 0,3 mol / l: przygotowany przez rozpuszczenie 1,2 g NaOH w 100 ml wody, stężenie sprawdza się przez miareczkowanie (powinno wynosić 0,3 n).

4. Orthotoluidyna, 1% roztwór: 1 g leku rozpuszcza się w 100 ml absolutnego alkoholu. Roztwór można przechowywać w lodówce w kolbie ze szklanym korkiem na kilka miesięcy. Dostępny w handlu produkt można oczyszczać przez rekrystalizację, do którego jest on rozpuszczany w absolutnym alkoholu, dodaje się wodę i wytrącone kryształy odsysa się na filtrze, a następnie suszy nad chlorkiem wapnia.

5. Roztwór buforu octanowego o pH 4,8: zmieszać 4 części 0,25 n kwasu octowego (sprawdzić przez miareczkowanie) i 6 części 0,25 n octanu sodu (zawiera 34 g CH3COONa X ЗН2О w 1 litrze).

6. Oksydaza glukozowa jest suchym preparatem o aktywności 3000 jednostek / mg lub więcej.

7. Peroksydaza chrzanowa. 1 mg rozpuszczono w 5 ml buforu octanowego, można go przechowywać w lodówce przez kilka dni.

8. Odczynnik roboczy: rozpuścić 2 mg oksydazy glukozy i 1 mg peroksydazy w 80 ml buforu octanowego, dodać 1 ml 1% roztworu orthotoluidyny, wymieszać i doprowadzić objętość do 100 ml roztworem buforowym. Odczynnik roboczy musi być przezroczysty, bezbarwny lub mieć słabo zielony odcień, w takim przypadku jest stabilny, gdy jest przechowywany w niskiej temperaturze. Jeśli kolor jest intensywny lub po kilku godzinach po przygotowaniu, osad zaczyna opadać, co oznacza, że orthotoluidyna nie jest wystarczająco czysta i wymaga rekrystalizacji.

9. Kalibracja roztworów glukozy. Glukoza jest wstępnie suszona w 37 ° C i przechowywana w eksykatorze. Najpierw przygotować roztwór zasadowy o stężeniu 50 mmol / l, w którym 180 mg substancji rozpuszcza się w 20 ml nasyconego roztworu (około 0,3%) kwasu benzoesowego. Z tego rozwiązania przygotować działające roztwory kalibracyjne zawierające 3; 6; 9; 12; 15; 18 i 21 mmol / l, dla których przyjmują 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 i 4,2 ml roztworu podstawowego i doprowadzić nasycony roztwór kwasu benzoesowego do objętości 10 ml. Roztwory te zawierają glukozę w takich samych stężeniach, jakie występują we krwi, co ułatwia obliczenia podczas kalibracji.

Postępy oznaczania glukozy metodą oksydazy glukozy

W probówkach wirówek dodać 1,1 ml roztworu chlorku sodu, 0,4 ml roztworu siarczanu cynku i 0,4 ml 0,3 n roztworu NaOH, wymieszać; w tym samym czasie tworzy się bardzo cienki żel wodorotlenku cynku, wprowadza się do niego 0,1 ml krwi lub roztworu kalibracyjnego, ponownie miesza i odwirowuje po 10 minutach z prędkością 3000 obrotów na minutę przez 10 minut.

Do 1 ml supernatantu dodać 3 ml odczynnika roboczego i delikatnie wymieszać.

Kolor stopniowo zaczyna się rozwijać, co w normalnej temperaturze pokojowej osiąga maksimum w 13-15 minut, a następnie stopniowo maleje. Fotometrycznie zawsze po tym samym okresie czasu po dodaniu działającego odczynnika w kuwetach o długości ścieżki optycznej 1 centymetr z filtrem czerwonego światła (długość fali 625 nm) wbrew doświadczeniom jałowym, które ustawia się jednocześnie z próbkami roboczymi, ale zamiast krwi, weź fizjologiczny roztwór chlorku sodu.

Podczas przygotowywania wykresu kalibracji zamiast próbek krwi pobiera się 0,1 ml odpowiedniego roztworu kalibracyjnego.

Obliczenie glukozy można przeprowadzić zgodnie z regułą proporcji lub harmonogramem kalibracji, aby zbudować stężenie glukozy (mmol / l) na jednej osi, a wartość ekstynkcji na drugiej.

Uwagi dotyczące metody oznaczania glukozy metodą oksydazy glukozy

1. Możesz najpierw uwolnić krew z pipety do izotonicznego roztworu chlorku sodu, a następnie dodać roztwory siarczanu cynku i NaOH.

2. Przy systematycznej pracy, nie ma potrzeby ciągłego budowania harmonogramu kalibracji dla wszystkich punktów, wystarczy przetworzyć próbkę zerową i 2-3 punkty w zakresie od 3 do 9 mmol / l dziennie, i zbudować pełny harmonogram kalibracji tylko podczas zmiany odczynników lub dostosowania procedury.

Metoda oksydazy glukozowej do oznaczania glukozy

Metodę oksydazy glukozy stosuje się do oznaczania stężenia glukozy wyłącznie w różnych płynach ustrojowych. Zaletą tego testu jest jego dokładność. Diagnostyka, w przeciwieństwie do szybkich metod, pozwala na ujawnienie ilości czystej glukozy, bez żadnych fruktozy i innych cukrów. Zasada reakcji polega na zabarwieniu roztworu, który powstaje w wyniku wzajemnego oddziaływania środków utleniających ze specyficznymi barwnikami. Ocena wyników badań przeprowadzana jest metodą kolorymetrii i porównywania z roztworami wzorcowymi.

Kiedy jest zalecana metoda oksydazy glukozowej?

Test ten służy do wykrywania upośledzonej tolerancji cukru i rozwoju przedcukrzycowych, jak również w szczytowej fazie choroby. Jednak analiza jest rzadko wykorzystywana do takich celów, ze względu na wysokie koszty i długi czas oczekiwania na wynik. Najczęściej oznaczanie glukozy we krwi i moczu za pomocą tej metody jest wykorzystywane w diagnostyce różnicowej chorób takich jak:

zespół nietolerancji laktozy;
nietolerancja fruktozy;
uwalnianie fruktozy z płynów ustrojowych;
zwiększone stężenie pentozy w moczu.

Niewątpliwą zaletą testu oksydazy glukozy jest jego dokładność.

Na czym opiera się ta metoda?

Istnieją różne metody oznaczania stężenia glukozy we krwi, ale najdokładniejsza jest oksydaza glukozy. Najważniejsze jest to, że interakcja cukru z tlenem w powietrzu utlenia odczynnik. Nadtlenek wodoru jest uwalniany do roztworu. Substancja ta oddziałuje z orthotoluidyną, tworząc barwny związek. Zachowanie tej reakcji wymaga obecności specjalnych enzymów. W reakcji utleniania musi występować oksydaza glukozy, a peroksydaza w barwieniu cieczy. Intensywność barwy roztworu będzie zależeć od zawartości glukozy i będzie najbardziej intensywna z jego wysoką zawartością.

Istota metody oksydazy glukozy do oznaczania glukozy

Ocena wyniku odbywa się za pomocą ilościowej metody fotometrii w tym samym przedziale czasowym. Upewnij się, że używasz roztworu kalibracyjnego, który zawiera pewną określoną dawkę cukru, a zaczynając od niego, możesz ocenić stężenie glukozy w płynach ustrojowych, często we krwi.

Jak przeprowadzana jest analiza?

Materiał jest pobierany od pacjenta na pusty żołądek. Do testu z użyciem krwi żylnej w ilości 5 ml. W przeddzień diagnozy pacjentowi przedstawiono ścisłą dietę. Pozwoli to ocenić wiarygodność wyniku i wykluczyć możliwe błędy analizy. Na 2 dni przed odstawieniem krwi pacjent musi zrezygnować ze złych nawyków picia i palenia. Konieczne jest również ograniczenie spożycia nadmiernie słodkich potraw i, w miarę możliwości, unikanie stresujących sytuacji.

Najczęściej ta metoda oznaczania stężenia glukozy jest wykonywana metodą wirowania, która służy do oddzielania elementów kształtowych. Ilość cukru oznacza się w osoczu. Po dodaniu wszystkich niezbędnych odczynników kolor obserwuje się po 20 minutach, jeśli badanie przeprowadza się w temperaturze pokojowej. Obliczanie poziomu glukozy przeprowadza się zgodnie z harmonogramem kalibracji lub stosując zasadę porcji.

Odczynniki do badań

W celu określenia cukru najdogodniejsze jest stosowanie szybkich metod oznaczania glukozy we krwi. Wynika to z łatwości użytkowania i szybkich rezultatów. Ponadto pacjent nie musi iść do laboratorium lub szpitala. Ale w przeciwieństwie do testu oksydazy glukozy taka diagnoza jest niewiarygodna. Ponieważ nie odróżnia glukozy od innych cukrów i określa ich stężenie razem.

Podstawą reakcji oksydazy glukozowej jest 9% roztwór chlorku sodu i 50% siarczanu cynku. Dodaje się je na etapie wirowania krwi. Ponadto należy użyć roztworu buforowego z kwasem octowym i octanem sodu. Metoda miareczkowania określa jej pH na poziomie 4,8. Następnie dodaje się oksydazę glukozy, co powoduje nadtlenek wodoru i peroksydazę, która bierze udział w barwieniu roztworu do pożądanego stężenia w celu uzyskania dokładnego wyniku.

Normy podczas analizy

Ilość cukru mierzona jest w specjalnych jednostkach - milimolach na litr roztworu.

Badania krwi oksydazy glukozowej należy wykonywać na czczo, a do tego celu stosuje się osocze lub surowicę. Wskaźnik jego liczby dla dorosłych zarówno kobiet, jak i mężczyzn wynosi 3,3-5,5. W przypadku dzieci w wieku poniżej 15 lat liczba ta jest nieco niższa i waha się od 3,2 do 5,3. U noworodków poziom glukozy we krwi wynosi 1,7-4,2. Zwiększenie wydajności obserwuje się w przypadku rozwoju pacjenta z cukrzycą lub z naruszeniem tolerancji glukozy. Ten stan to stan przedcukrzycowy, a jeśli nie jest leczony w odpowiednim czasie, to wkrótce doprowadzi do rozwoju tej ciężkiej patologii.

Numer roboczy 1. ILOŚCIOWE OZNACZANIE GLUKOZY W KRWI. METODA ENZYMATYCZNA (GLUKOKSYKSALNA)

UZASADNIENIE W CELU WYKONYWANIA PRACY. Oznaczenie stężenia glukozy w krwi pełnej lub osoczu wykonuje się u każdego pacjenta, aby ocenić stan metabolizmu węglowodanów i zdiagnozować patologię (hiperglikemia, hipoglikemia). Metoda enzymatyczna oparta na utlenianiu glukozy przez oksydazę glukozy do kwasu glukonowego w obecności tlenu służy do oznaczania zawartości glukozy we krwi. Metoda ta jest wysoce swoista dla oznaczania D-glukozy w obecności innych substancji redukujących zawartych w ekstraktach tkankowych i płynach biologicznych.

ZASADA METODY. Oksydaza glukozowa jest złożonym enzymem zawierającym FAD jako grupę prostetyczną. Kiedy glukoza jest utleniana przez oksydazę glukozy, dwa atomy wodoru oddzielają się od pierwszego atomu węgla w cząsteczce glukozy. Ponadto, te dwa atomy wodoru są przenoszone do FAD, powstaje FADH₂. Ten ostatni przenosi atomy wodoru do tlenu cząsteczkowego, tworząc H₂Och₂. Następnie H₂Och₂ jest odszczepiany przez enzym peroksydazowy do wody i tlenu atomowego, który utlenia chromogen (barwnik), który staje się zabarwiony podczas utleniania.

Metoda oksydazy glukozowej

Obecnie najczęściej stosuje się metody oparte na zastosowaniu enzymu oksydazy glukozowej. Metoda opiera się na następującej reakcji:

Oksydaza glukozowa katalizuje przeniesienie dwóch atomów wodoru z pierwszego atomu węgla glukozy do tlenu rozpuszczonego w ciekłym odczynniku. W trakcie reakcji nadtlenek wodoru tworzy się w ilościach równomolowych. Tj stężenie powstałego nadtlenku wodoru jest dokładnie równe ustalonemu stężeniu glukozy. W konsekwencji zastosowanie reakcji oksydazy glukozy przekształciło problem określania stężenia glukozy w problem oznaczania stężenia nadtlenku wodoru, który, jak zostanie pokazane poniżej, jest znacznie prostszy niż pierwszy. A tutaj jest kilka metod, które są dziś powszechnie stosowane w praktyce laboratoryjnej (patrz schemat).

Spośród wymienionych sposobów rejestrowania najczęściej fotometryczne metody biochemiczne, w którym cząsteczki nadtlenku wodoru z enzymem peroksydazą cięte w celu utworzenia aktywnej postaci tlenu - anionu ponadtlenkowego rodnik - o₂ -, który z kolei utlenia chromogen, co prowadzi do znaczącej zmiany w widmie absorpcji chromogenu.

Duża popularność tej metody oznaczania glukozy wynika z jej wysokiej specyfiki i łatwości implementacji. Metodę można zaimplementować za pomocą tradycyjnego fotometru, a także za pomocą automatycznych biochemicznych autoanalizatorów.

Metoda oksydazy glukozowej jest dziś uznawana za jedną z najdokładniejszych ilościowych metod oznaczania glukozy. Jako materiał biologiczny stosuje się surowicę i krew pełną. Podczas pracy z nim należy wziąć pod uwagę fakt, że zdobycie proporcji surowicy krwi kapilarnej (plazmy) zależy od hematokrytu, co może niekorzystnie wpłynąć na dokładność wyniku. Dlatego przy oznaczaniu glukozy metodą opisaną powyżej zaleca się stosowanie surowicy pacjenta.

Wraz z metodą fotometrii końcowego, kilka lat temu, nie były zestawy, które implementują kinetycznej metody fotometrii. Sposób polega na tym, że w określonym stosunku oksydazy glukozy i aktywności peroksydazy, szybkość tworzenia związków barwnych przez pewien czas po dodaniu próbki roztworu roboczego jest proporcjonalna do stężenia glukozy w próbce. Zaletą tej metody jest to, że wynik nie zależy od obecności innych związków w próbce, ponieważ absorpcja tej ostatniej jest stabilna w czasie. Ta metoda wymaga zastosowania fotometru kinetycznego, półautomatycznych analizatorów lub automatycznych analizatorów biochemicznych. Pomiar stężenia glukozy z krwi pełnej jest dogodnie wykonywany za pomocą przyrządów, których działanie opiera się na amperometrycznej zasadzie pomiaru, przy użyciu specjalnych czujników enzymatycznych. Nadtlenek wodoru jest wyjątkowo niestabilnym związkiem chemicznym i może służyć jako źródło naładowanych cząstek. To właśnie stosuje się w czujnikach enzymatycznych typu membranowego lub w elementach elektrochemicznych przenośnych glukometrów.

Podsumowując, należy wspomnieć o wadach metody oksydazy glukozowej. Otrzymany nadtlenek wodoru i rodnika anionową, nie tylko można utleniać chromogen, ale inne materiały obecne w płynie biologicznym: kwas askorbinowy, kwas moczowy, bilirubiny. W tym przypadku, zgodnie z tym, część nadtlenku, biorąc udział w utlenianiu chromogen jest zmniejszona, co prowadzi do niedoszacowania wyniku glukozy. Ta metoda jest z zasady liniowa do 20-30 mmol / l glukozy.

Ilościowe oznaczanie stężenia glukozy we krwi metodą oksydazy glukozowej

Zasada metody. Metoda opiera się na specyfice działania enzymu oksydazy glukozy. Enzym ten utlenia glukozę w obecności tlenu cząsteczkowego, tworząc glukonolakton, który spontanicznie hydrolizuje do kwasu glukonowego. Oksydaza glukozowa utlenia glukozę, tworząc nadtlenek wodoru (H.₂Och₂), który pod wpływem peroksydazy reaguje z 4-aminoantipiryną i fenolem. Wynikiem jest związek w kolorze różowym, którego gęstość optyczna przy 510 nm jest proporcjonalna do stężenia glukozy w próbce.

2 N₂Och₂ + 4-aminoantipiryna + fenol → imin chinonu + 4H₂Och

Wyposażenie: KFK, wirówka, termostat, statywy, probówki, pipety, materiał biologiczny, odczynniki zawarte w roztworze roboczym.

próbka testowa, ml

standardowa próbka, ml

pojedynczy test (N₂O), ml

Kalibracja roztworu glukozy (standard)

Probówki inkubuje się w termostacie w temperaturze 37 ° C przez 15 minut, a następnie w co UFC kolorimetriruyut filtra zielonego światła w komórkach o grubości od 5 mm w porównaniu do ślepej próby (H₂O). Różowy kolor jest stabilny przez 1 godzinę po inkubacji.

Obliczanie zawartość glukozy wytwarzana według wzoru:

C = x C standard, gdzie

C oznacza zawartość glukozy w próbce doświadczalnej, mol / l;

Eop jest gęstością optyczną próbki;

Est jest gęstością optyczną próbki kalibracyjnej;

С standard - zawartość roztworu kalibracyjnego, mol / l.

Normalne wartości:  noworodki - 2,8-4,4 mmol / l

 dzieci - 3,9 -5,8 mmol / l

 osoby dorosłe - 3,9 - 6,2 mmol / l

Hipoglikemia (HGH). Wzrost stężenia glukozy we krwi wynika z wielu przyczyn, zgodnie z którymi istnieją dwie grupy hiperglikemii.

1. Insular - związany z niedostateczną zawartością insuliny lub z powodu nieskuteczności jej działania.

2. Extrainsular (pozaszpikowych) - nie zależą od działania insuliny.

Następujące procesy są najbardziej znaczące w tworzeniu HGH: zwiększony rozkład glikogenu; zwiększona neoglukogeneza; hamowanie syntezy glikogenu; spadek w wykorzystaniu glukozy przez tkanki pod wpływem antagonistów hormonu insuliny: hormon wzrostu, glukokortykoidy, tyroksyna, tyreotropiny.

U pacjentów z nadmierną podaż glukozy we krwi obserwuje się nadmierną glikemię pokarmową (na przykład hiperglikemia pod wpływem cukru). Hiperglikemia "wątrobowa" występuje w rozproszonych zmianach w wątrobie.

Uporczywa i ciężka hiperglikemia najczęściej towarzyszy cukrzycy. Akceptowane zapewnić insulinoniezależnej cukrzycy i insulinoniezależnej cukrzycy, lub, odpowiednio, cukrzyca typu I i cukrzyca typu II. Powstawanie cukrzycy typu I wiąże się przede wszystkim z upośledzoną syntezą i wymianą insuliny.

Druga grupa hiperglikemii związana jest przede wszystkim z nadczynnością gruczołów dokrewnych wytwarzających hormony - antagonistów insuliny. Jest ona obserwowana w chorobach, takich jak zespół Cushinga i chorób, akromegalia, nadczynność tarczycy, barwiaka glyukoganoma. Poziom glukozy we krwi i w pewnych chorobach wątroby (w szczególności 10-30% pacjentów z marskością wątroby), hemochromatoza (pigment marskość wątroby, cukrzyca brązu).

Hipoglikemia (HGP) - spadek stężenia glukozy we krwi - najczęściej związany z bezwzględnym lub względnym wzrostem poziomu insuliny we krwi. Vnepankreaticheskim hipoglikemia obserwowane jako rezultat braku równowagi pomiędzy zakresem procesy glikogenolizy i glukoneogenezy w wątrobie, podczas ostrego i przewlekłego zapalenia wątroby, marskości wątroby, ostre i podostre choroby wątroby, pozostawanie pod wpływem alkoholu, zatrucia arsenu, fosforu, podczas długotrwałego żółtaczki mechanicznej, zastoinowej wątroby, pierwotnego lub przerzutowego raka wątroby. Obniżenie stężenia glukozy we krwi często obserwuje się u pacjentów z rakiem przełyku i innych nowotworów złośliwych vnepankreaticheskim lokalizacji (włókniak, włókniakomięsaka, nerwiaka), jak i niekontrolowane wymioty, brak łaknienia, cukrzyca, mocznica, wątroby obfitej laktacji i cukromocz ciężarnych kobiet.

Hipoglikemia może mieć centralne pochodzenie z powodu urazu psychicznego, zapalenia mózgu, krwotoku podpajęczynówkowego, guza mózgu.

1. Dziedziczne zaburzenia trawienia węglowodanów.

2. Jakie rodzaje hiperglikemii są ci znane?

3. Jakie są przyczyny patologicznej hiperglikozydii?

4. Jaka jest przyczyna cukrzycy insulinozależnej?

5. Jakie są biochemiczne przyczyny chorób dziedzicznych: a) glikogenoza? b) aglycogenosis? c) fruktozemia? d) galaktozemia?

6. Jakie są biochemiczne zmiany w metabolizmie węglowodanów podczas postu?

7. Zasada metody określania tolerancji glukozy.

Metody oksydazy glukozowej i heksokinazy do oznaczania stężenia glukozy w surowicy we krwi

Dokładna diagnoza, przepisane leczenie wymaga serii testów laboratoryjnych.

Metoda określania stężenia glukozy w surowicy jest najważniejszym narzędziem do wykrywania hiper- i hipoglikemii u pacjentów z cukrzycą.

Metoda pozwala dostosować zaburzenia metaboliczne danych terapii medycznej. Diagnostyczne poziomy glukozy można również oznaczać w pełnej krwi i jej osoczu.

Metody oznaczania stężenia glukozy we krwi

Szybko rozwinęły się metody oznaczania ilości glukozy we krwi.

Niektóre z nich (redukcyjne, kolorymetryczne) są praktycznie nieużywane z powodu wysokiej toksyczności i niskiej dokładności wyników.

Najczęściej stosowane badania enzymatyczne. Metoda oksydazy glukozowej jest metodą reakcji barwnej, która występuje podczas ogrzewania węglowodanów. Heksokinaza określa aktywność krwi na heksokinazie.

Metoda oksydazy glukozowej

Metoda oksydazy glukozy do oznaczania stężenia glukozy we krwi opiera się na jej reakcji utleniania pod wpływem enzymu. Tworzy on nadtlenek wodoru, który barwi substancję Chromogen, której stężenie określa ilość glukozy.

Metodę oksydazy glukozy stosuje się do:

dziedziczna nietolerancja fruktozy;
pentozurii;
nietolerancja laktozy.

Wadą tego badania jest to, że nadtlenek wodoru jest zdolny do utleniania zarówno chromogenu, jak i kwasu askorbinowego, kwasu moczowego i bilirubiny obecnych we krwi. Oblicz ilość metody fotometrycznej glukozy, intensywność barwienia jest porównywana z wykresem kalibracji.

W warunkach laboratoryjnych można określić poziom substancji:

w krwi żylnej. Używane są automatyczne analizatory;
w krwi włośniczkowej. Ogrodzenie wykonuje się od palca.

Metoda elektrochemiczna polega na użyciu elektrod zawierających oksydazę glukozy. Określa się ilość wytworzonego nadtlenku wodoru lub pozostały poziom tlenu zużytego podczas procesu utleniania.

Metoda heksokinaz

Substancja jest najważniejszym enzymem metabolizmu glukozy, który ogranicza szybkość procesu w komórkach.

W warunkach laboratoryjnych pod wpływem heksokinazy glukoza jest fosforylowana przez trifosforan adenozyny.

W wyniku reakcji powstają cząsteczki organiczne, których ilość zależy od poziomu absorpcji światła w strefie nadfioletowej. Zbyt szybka reakcja dodatnia heksokinazy może być również oznaką występowania nowotworów złośliwych.

Przygotowanie do analizy

Testy glukozy w surowicy krwi są przepisywane dla:

Przed analizą musisz przestrzegać kilku warunków, aby wyniki były jak najbardziej wiarygodne:

badania prowadzone są na czczo. Materiał pobrany rano;
na kilka dni przed diagnozą należy unikać ciężkiego wysiłku fizycznego, stresu;
W codziennej diecie pacjenta musi być co najmniej 150 gramów węglowodanów. Przy niedoborze wzrasta poziom glukozy i spada powoli, co zniekształca analizę danych;
dzień przed diagnozą nie można palić i pić napojów alkoholowych;
niemożliwe jest przeprowadzenie badań po ciężkich operacjach, porodzie, w obecności stanów zapalnych. Przeciwwskazane do analizy marskości wątroby, zaostrzeń chorób żołądka, procesów nowotworowych;
na kilka dni przed badaniem nie należy poddawać się zabiegom fizjoterapeutycznym, przyjmować doustnych środków antykoncepcyjnych, leków moczopędnych, leków psychotropowych, kofeiny.

Analiza może dać fałszywie dodatni wynik w hipokaliemii i chorobach endokrynologicznych (zespół Cushinga, tyreotoksykoza).

Normy glukozy w surowicy krwi według wieku

Normalne wskaźniki zależą od wieku:

krew pępowinowa może zawierać od 2,5 do 5,3 mmol / l;
u wcześniaków - od 1,1 do 3 mmol / l;
dzieci pierwszego dnia życia - od 2,22 do 3,33;
w wieku od 2,7 do 4,4;
u dzieci w wieku powyżej 6 lat - od 3,3 do 5,5 mmol / l;
u dorosłych do 60 lat - od 4,4 do 6,3;
u osób starszych - od 4,6 do 6,1 mmol / l.

Hipoglikemię u dorosłych rozpoznaje się z wartościami glukozy poniżej 3,3 mmol / l, a hiperglikemia - ponad 6,1 mmol / l.

Metoda oksydazy glukozowej do oznaczania stężenia glukozy w osoczu

Miło nam powitać Cię na stronie www.unimedao.ru!

Dziękujemy za odpowiedź na nasze pytanie.

11-19/2009

Gerasimenko V.A., Ph.D., Kurilyak O.A., Ph.D.

Z archiwum gazety "News A / O Unimed"

Oznaczanie stężenia glukozy we krwi jest jednym z najczęściej wykonywanych badań biochemicznych w QDL. Powodem wyjątkowej popularności testu jest wysoka częstość występowania cukrzycy. Ten test jest wykonywany zarówno w przychodniach, jak i ambulatoriach. Pacjenci chorzy na cukrzycę są zmuszeni do zbadania poziomu glukozy we krwi w domu, ponieważ bez tej informacji trudno jest im dostosować dietę, ćwiczenia fizyczne, stosowanie insuliny i innych leków przeciwcukrzycowych. Wyjątkowe znaczenie testu i duże ilości przeprowadzonych badań pobudzały twórców do tworzenia różnego rodzaju urządzeń i metod określania stężenia glukozy we krwi.

Obecnie istnieje wiele metod oznaczania glukozy. Można je sklasyfikować w następujący sposób.

Metody oznaczania glukozy w surowicy

- fotometryczny punkt końcowy

- fotometria odbiciowa - sucha chemia

Pierwsze dwie metody są wyjątkowo niewygodne, toksyczne i mają małą dokładność, więc nie będziemy się nad nimi rozwodzić.

Metoda oksydazy glukozowej

Obecnie najczęściej stosuje się metody oparte na zastosowaniu enzymu oksydazy glukozowej. Metoda opiera się na następującej reakcji:

Na rys. Rysunki 1 i 2 pokazują widma roztworu roboczego przed i po dodaniu standardowego roztworu glukozy. Maksymalna absorpcja mieszaniny reakcyjnej - (odczynnik + glukoza) mieści się w zakresie 500 nm. W związku z tym zmiana gęstości optycznej końcowej reakcji przy długości fali 480-520 nm jest proporcjonalna do stężenia glukozy zawartej w próbce.

Duża popularność tej metody oznaczania glukozy wynika z jej wysokiej specyfiki i łatwości implementacji. Metodę można wdrożyć przy użyciu konwencjonalnego fotometru (lepiej niż specjalistyczny fotometr biochemiczny, taki jak Mikrolab 540) lub za pomocą automatycznych biochemicznych autoanalizatorów.

Wraz z metodą fotometrii końcowego, kilka lat temu, nie były zestawy, które implementują kinetycznej metody fotometrii. Sposób polega na tym, że w określonym stosunku oksydazy glukozy i aktywności peroksydazy, szybkość tworzenia związków barwnych przez pewien czas po dodaniu próbki roztworu roboczego jest proporcjonalna do stężenia glukozy w próbce. Zaletą tej metody jest to, że wynik nie zależy od obecności innych związków w próbce, ponieważ absorpcja tej ostatniej jest stabilna w czasie. Ta metoda wymaga użycia fotometru kinetycznego, na przykład Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, półautomatycznych analizatorów, takich jak Clima 15, lub automatycznych analizatorów biochemicznych. Pomiar stężenia glukozy z krwi pełnej jest dogodnie wykonywany za pomocą przyrządów, których działanie opiera się na amperometrycznej zasadzie pomiaru, przy użyciu specjalnych czujników enzymatycznych. Nadtlenek wodoru jest wyjątkowo niestabilnym związkiem chemicznym i może służyć jako źródło naładowanych cząstek. To właśnie stosuje się w czujnikach enzymatycznych typu membranowego lub w elementach elektrochemicznych przenośnych glukometrów.

Próbkę krwi pełnej (zwykle 20 μl) rozcieńcza się w roztworze buforowym układu (czerwone krwinki są niszczone), a następnie wprowadza się przez linię do komory przepływowej. Glukoza ulega utlenieniu pod wpływem enzymu oksydazy glukozowej, umiejscowionego na membranie. Powstały nadtlenek wodoru dyfunduje przez membranę i jest utleniany dalej w reakcji katalitycznej pod działaniem platyny. Dyfuzja nadtlenku wodoru na powierzchni platyny tworzy prąd proporcjonalny do liczby cząsteczek H₂Och₂. Uzyskany w ten sposób sygnał jest przetwarzany przez urządzenie przy odpowiedniej wartości napięcia. Ta zmierzona wartość jest proporcjonalna do stężenia glukozy w próbce.

Jako przykład instrumentów wykorzystujących opisaną powyżej metodę, można wymienić analizatory glukozy Biosen (Niemcy). Urządzenia te są wygodne do stosowania nie tylko w szpitalach, ale także w poliklinikach, gdzie testowanie glukozy odbywa się głównie z krwi włośniczkowej.

Ważnym krokiem w rozwoju klinicznych metod diagnostyki laboratoryjnej było pojawienie się "chemii suchej". Oczywiście jednym z pierwszych zastosowań tej technologii było określenie poziomu glukozy we krwi pacjenta. Pierwsze urządzenia były znacznie gorsze pod względem dokładności niż tradycyjne metody badań laboratoryjnych. Jednak z biegiem czasu wiele firm zdołało opracować paski diagnostyczne i fotometry odblaskowe, które zapewniły bardzo wysoką dokładność analizy. Glukometry One Touch i paski testowe Life Scan (USA) są szeroko rozpowszechnione na całym świecie i skutecznie łączą analityczną dokładność ilościowej metody enzymatycznej z szybkością i prostotą "chemii suchej".

Mierniki glukozy we krwi One Touch zostały zaprojektowane, aby szybko i dokładnie mierzyć poziom glukozy we krwi. Pasek testowy One Touch zawiera wszystkie niezbędne składniki chemiczne do dwuetapowej metody oksydazy glukozy, w tym enzymy oksydazy glukozy i peroksydazy, które są adsorbowane na unikalnej porowatej membranie hydrofilowej. W wyniku reakcji powstaje kolorowy kompleks. Intensywność opracowanego koloru jest rejestrowana za pomocą miniphotometru odbijającego.

Pasek testowy membranowy One Touch przypomina gąbkę o mikroskopijnych porach i pełni potrójną funkcję. To funkcje: 1) jako zbiornika, zbierając odpowiednią ilość krwi, 2) w postaci filtra, blokowanie stałego materiału komórkowego (erytrocytów, leukocytów, etc.), 3) w postaci gładkiej powierzchni optycznej, w której odbija światło jest mierzone.. Ta ostatnia funkcja jest szczególnie ważna dla działania urządzenia. Umożliwia odczyt dolnej części paska, podczas gdy krew pozostaje w górnej części paska testowego. W związku z tym nie ma potrzeby mycia (plam) krwi z powierzchni paska testowego.

Ponadto, membrana ma właściwości hydrofilowe, dzięki czemu kropla krwi "przyciąga" do powierzchni paska testowego, gdy dotknie.

Urządzenie One Touch zawiera dwie specjalne diody LED. Przetwarzanie opracowanego koloru na pasku testowym jest następujące. Jak tylko pasek testowy zostanie włożony do urządzenia, pojawia się odczyt zerowy. W tym momencie na wyświetlaczu widzimy: "CZEKAJ". Kiedy na pasek testowy nakładana jest kropla krwi, osocze krwi jest natychmiast sorbowane przez membranę, podczas gdy erytrocyty i nadmiar plazmy pozostają na powierzchni membrany. Po całkowitym wchłonięciu kropli krwi natychmiast pojawia się zabarwienie. Urządzenie rejestruje zmianę wielkości odbicia i automatycznie uruchamia zegar. Po 45 sekundach reakcja chemiczna zostaje zakończona, powstaje wynik odbicia światła. Kolorowy produkt reakcji pochłania światło emitowane przez pierwszą diodę LED. Komórki krwi i nadmiar plazmy pochłaniają również światło emitowane przez diodę. W celu skorygowania odbicia tła, drugie odczytanie jest wykonywane przez drugą diodę LED o innej długości fali. Różnica między sygnałami z pierwszej i drugiej diody LED przenosi informację o absorpcji światła przez chromogen. Sygnał otrzymany z chromogenu w celu oszacowania stężenia glukozy jest skorelowany ze specjalną kalibracją. Wszystkie urządzenia One Touch są kalibrowane przy użyciu metody referencyjnej w laboratoryjnym glukometrze. Za pomocą tej procedury uzyskuje się standardową krzywą kalibracji. Należy zauważyć, że raczej trudno jest ustalić produkcję pasków testowych, które byłyby absolutnie takie same chemicznie, ze względu na bardzo niskie stężenie odczynników. Aby rozwiązać ten problem, stosuje się standardową krzywą kalibracji składającą się z 16 linii kalibracyjnych. Kontrolę jakości przeprowadza się bezpośrednio po wyprodukowaniu pasków testowych, co pozwala określić, które linie kalibracyjne (od 1 do 16) można zastosować do tego paska testowego. Jest to tak zwany numer kodu, który jest przymocowany do opakowania paska testowego. Te 16 linii kalibracyjnych jest również zaprogramowane w mikroprocesorze instrumentu. Aby uzyskać optymalnie dokładne wyniki, numer kodu wskazany na opakowaniu pasków testowych jest ustawiany w urządzeniu za pomocą przycisku kodu. W związku z tym niepoprawnie zainstalowany kod na przyrządzie może spowodować błąd pomiaru.

Od czasu pojawienia się urządzeń One Touch na rynku, w laboratoriach Rosji, Ameryki i Europy minęło wiele badań klinicznych. Jedno z takich badań zostało przeprowadzone przez Centrum Nauk Endokrynologicznych Rosyjskiej Akademii Nauk Medycznych na zlecenie Rosyjskiego Stowarzyszenia Diagnostyki Laboratoryjnej Medycznej. Specjaliści Centrum przeprowadzili analizę porównawczą dwóch metod pomiaru poziomu glukozy we krwi. Wyniki uzyskane na One Touch porównano z danymi uzyskanymi w analizatorze biochemicznym Spectrum II (Abbott Laboratories, USA), który stosuje metodę heksokinazy do oznaczania glukozy. Zbadano 190 próbek krwi od 95 pacjentów. Współczynnik korelacji wyników wyniósł 0,98641. Współczynnik zmienności w normalnych i patologicznych zakresach miernika One Touch nie przekracza 2,5%.

W oficjalnym raporcie Centrum Badań Endokrynologicznych Rosyjskiej Akademii Nauk Medycznych napisano: "Urządzenia One Touch mają wysoką dokładność i dokładność, a także szeroki zakres pomiarów. Mogą być używane do diagnozowania stanów nagłych w cukrzycy, w tym zespołów ratowniczych, ponieważ te urządzenia są nie tylko niezawodne, ale także szybko osiągają wyniki. "

Metoda heksokinaz

Rejestracja odbywa się przy długości fali 340 nm na absorpcji NADH. Ta metoda jest wysoce specyficzna i nie reaguje z innymi składnikami surowicy krwi. Metoda heksokinazowa jest uważana za referencję do oznaczania glukozy. Zasadniczo jest liniowy do 50 mmol / l, co pozwoliło na jego szerokie zastosowanie w klinikach z oddziałami endokrynologicznymi.

Spośród opisanych metod oznaczania glukozy pracownicy QDL mogą sami zdecydować, która metoda określania i jakie urządzenie wybrać:

Metody "mokrej" biochemii, realizowane na automatycznych analizatorach biochemicznych, dostarczą potrzebom laboratoriów dużego przepływu analiz.
Analizatory poziomu glukozy Biosenego wymagają minimalnego wysiłku ze strony operatora, ponieważ są w pełni zautomatyzowane i wystarczająco wydajne (prędkość od 50 do 200 próbek na godzinę).
W laboratoriach o niewielkiej liczbie badań, jak również w laboratoriach ekspresowych, dogodny jest specjalistyczny fotometr biochemiczny Mikrolab 540.
W przypadku zespołów pomocy ukrywanie pomocy jest idealnym rozwiązaniem - glukometry, takie jak One Touch.

W związku z tym zadanie QDL, aby zapewnić nie tylko szybkie, ale również bardzo dokładne oznaczanie glukozy, jest w pełni możliwe do rozwiązania dzisiaj.

Glukoza, mocz, alkohol

Poziom glukozy we krwi jest ściśle kontrolowany.

Kontrola stężenia glukozy we krwi odbywa się za pomocą wpływów nerwowych i hormonów.

Regulacja nerwowa

Nerwowa regulacja stężenia glukozy we krwi wyraża się w pozytywnym działaniu n. Vagus na wydzielanie insuliny i hamujący wpływ na ten proces unerwienia współczulnego. Ponadto uwalnianie adrenaliny do krwi podlega współczulnym wpływom.

Regulacja hormonalna

Głównymi czynnikami regulacji hormonalnej są: glukagon, adrenalina, glukokortykoidy, hormon somatotropowy z jednej strony i insulina z drugiej. Wszystkie hormony, z wyjątkiem insuliny, wpływające na wątrobę, zwiększają glikemię.

Insulina jest jedynym hormonem w organizmie, który ma na celu obniżenie poziomu glukozy we krwi. Dzięki jej wpływowi glukoza jest silnie absorbowana przez mięśnie i tkankę tłuszczową.

Obniżenie stężenia glukozy we krwi przez insulinę osiąga się w następujący sposób:

przejście glukozy do komórek - aktywacja białek transportujących GluT 4 na błonie cytoplazmatycznej,
zaangażowanie glukozy w glikolizę - wzrost syntezy glukokinazy, enzym zwany pułapką glukozy, stymulacja syntezy innych kluczowych enzymów glikolizy - fosfoutruktokraza, kinaza pirogronianowa,
zwiększona synteza glikogenu - aktywacja syntazy glikogenu i stymulacja jego syntezy, co ułatwia konwersję nadmiaru glukozy do glikogenu,
aktywacja szlaku pentozofosforanowego - indukcja syntezy dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej i dehydrogenazy 6-fosfoglukonianowej,
zwiększona lipogeneza - udział glukozy w syntezie triacylogliceroli lub fosfolipidów.

Wiele tkanek jest całkowicie niewrażliwych na działanie insuliny, są one nazywane insulinozależnymi. Należą do nich: tkanka nerwowa, ciało szkliste, soczewka, siatkówka, kłębuszkowe komórki nerkowe, komórki śródbłonka, jądra i czerwone krwinki.

Glukagon podnosi poziom glukozy we krwi:

zwiększenie mobilizacji glikogenu poprzez aktywację fosforylazy glikogenu,
stymulowanie glukoneogenezy - zwiększenie aktywności enzymów pirokwasu karboksylazy, karboksykinazy fosfoenolopirogronianowej, fruktozy-1,6-difosfatazy.

Adrenalina powoduje hiperglikemię:

aktywacja mobilizacji glikogenu - stymulacja fosforylazy glikogenu,

Glukokortykosteroidy zwiększają stężenie glukozy we krwi

poprzez hamowanie przejścia glukozy do komórki,
stymulowanie glukoneogenezy - zwiększenie syntezy enzymów karboksylazy pirogronianowej, karboksykinazy fosfoenolopirogronianowej, 1,6-difosfatazy fruktozy.

W tabeli podsumowano główne aspekty wpływów hormonalnych:

Aktywacja glikogenolizy w wątrobie;
Stymulacja glukoneogenezy;

Zwiększona glukoneogeneza;
Zmniejszona przepuszczalność membrany na glukozę.

Poziom glukozy we krwi w praktyce klinicznej

Ponad 90% wszystkich rozpuszczalnych węglowodanów o niskiej masie cząsteczkowej to glukoza; ponadto fruktoza, maltoza, mannoza i pentoza mogą występować w niewielkich ilościach, aw przypadku patologii galaktozy. Wraz z nimi we krwi zawiera polisacharydy związane z białkami.

Szczególnie intensywnie glukoza jest zużywana i wykorzystywana do różnych potrzeb tkanki centralnego układu nerwowego, czerwonych krwinek, rdzenia nerkowego. W pośrednim metabolizmie glukoza jest używana do tworzenia glikogenu, glicerolu i kwasów tłuszczowych, aminokwasów, kwasu glukuronowego i glikoprotein. Stężenie glukozy we krwi jest pochodną glikolizy i utleniania kwasów trokarboksylowych w cyklu TCA, glikogenezy i glikogenolizy w wątrobie i tkance mięśniowej, glukoneogenezy w wątrobie i nerkach oraz spożycia glukozy z jelita.

W praktyce klinicznej zwykle bada się poziom glukozy we krwi, stężenie innych cukrów i glikogenu stosuje się znacznie rzadziej. W ludzkiej krwi glukoza jest dość równomiernie rozłożona między osoczem a uformowanymi pierwiastkami, ustalono, że zawartość cukru we krwi żylnej wynosi 0,25-1,0 mmol / l (średnio 10%) mniej niż w krwi tętniczej i krwi włośniczkowej. Definicja kwasu mlekowego i pirogronowego, aktywność wielu enzymów metabolizujących węglowodany, kwasów sialowych i heksuronowych, seromukoidów, hemoglobiny glikozylowanej i innych wskaźników ma znaną wartość diagnostyczną.

Zawartość glukozy w moczu zależy od jej stężenia we krwi, chociaż jest wydzielana zarówno w prawidłowym, jak i podwyższonym stężeniu cukru we krwi. Wraz ze wzrostem stężenia glukozy we krwi zostaje przezwyciężony tzw. Próg nerkowy (u osób zdrowych leży w granicach 8,3-9,9 mmol / l) i pojawia się glukozuria. W przypadku arteriosklerotycznej nerki, z cukrzycą, próg wzrasta, a glukozuria może nie występować nawet przy wzroście stężenia glukozy do 11,0-12,1 mmol / l.

Metody oznaczania stężenia glukozy we krwi

Metody oznaczania stężenia glukozy we krwi są podzielone na trzy grupy: redukcja, kolorymetria i enzymatyczna.

Metody redukcji (Należy pamiętać, że metody z tej grupy dają przeszacowane wyniki (o około 20-25%), ponieważ krew zawiera wiele związków niezwiązanych z węglowodanami, ale mających właściwości redukujące (kwas moczowy, glutation, kreatynina, askorbinowy acid)):
- Metoda titrometryczna Hagedorna-Jensena opiera się na właściwościach cukru, które przywracają, gdy gotuje się w środowisku alkalicznym, sole żelaza i sinu i żelaza-sludinianu potasu. Zgodnie ze stopniem tego wyzdrowienia stężenie cukru we krwi jest badane za pomocą titrometrii. Ważną zaletą tej metody jest jej niski koszt i możliwość zastosowania w dowolnym laboratorium;
- w oparciu o redukcję nitrobenzenów, na przykład, kwas pikrynowy do kwasu pikrynowego;
- metoda oparta na zdolności glukozy do redukcji soli miedzi. Otrzymana monowalentna miedź działa jako półprodukt. Utleniony tlenem powietrza, przywraca kwas arsenowo-molibdenowy lub kwas fosforotrójbazowy, które służą jako ostateczny chromogen.
Metody kolorymetryczne. Należą do nich:
- Metoda Somodzhi - reakcja redukcji miedzi, która jest w składzie odczynnika miedziowo-ortronowego, do tlenku miedzi. Metoda jest pracochłonna, wielostopniowa, niespecyficzna i praktycznie nie jest obecnie używana;
- Metoda Folin-Wu - redukcja winianu miedzi na tlenek litu. Metoda jest prosta, wadą jest brak ścisłej proporcjonalności między intensywnością uzyskanego koloru a stężeniem glukozy;
- oznaczanie stężenia glukozy według Morrisa i Roe - odwodnienie glukozy pod działaniem kwasu siarkowego i jego przekształcenie w oksymetylofurfural, który skrapla się z arthronem do niebieskiego związku. Wymaga najczystszych odczynników i ścisłego przylegania do stałej temperatury reakcji;
- Metoda orthotoluidynowa Gultmana w modyfikacji Khivarinen-Nikkil, polegająca na określeniu intensywności wybarwienia roztworu, która występuje, gdy aromatyczna amina orthotoluidyna oddziałuje z grupą aldehydową glukozy w środowisku kwaśnym. Ta metoda jest dokładna i pozwala na bardziej szczegółowe oznaczanie glukozy.
- Metoda anilinowa zachowuje czułość metody orthotoluidynowej, ale jest jeszcze bardziej specyficzna.
Metody enzymatyczne:
- w oparciu o reakcję heksokinazy. Glukoza pod wpływem heksokinaz jest fosforylowana przez ATP, powstały Gl - 6 - F w obecności dehydrogenazy przywraca NADP. Ilość tego ostatniego jest określona przez wzrost absorpcji światła w obszarze ultrafioletowym. Metoda ta jest zbyt kosztowna dla praktycznych laboratoriów.
- oparty na utlenianiu glukozy do kwasu glukuronowego przy użyciu enzymu oksydazy glukozy i powstawania podczas reakcji nadtlenku wodoru, który (w różnych wersjach):
  - określane za pomocą środków chemicznych;
  - przy udziale peroksydazy utlenia bezbarwną ortotolidynę, zmieniając ją w związek o barwie zielono-niebieskiej, prostoliniowość zależności kolorystycznej od stężenia glukozy pozostaje w zakresie od 1,1 do 22 mmol / l;
  - w obecności fenolu z udziałem peroksydazy utlenia 4-aminoantypirynę do barwionego szkarłatnego związku;
  - w obecności jonów miedzi utlenia fenoloftalinę do fenoloftaleiny, która jest zabarwiona na czerwono w warunkach alkalicznych.
Metody elektrochemiczne wykorzystujące elektrody zawierające immobilizowane enzymy, w szczególności oksydazę glukozy. Reakcję rejestruje się ilością utworzonego nadtlenku wodoru lub stratą tlenu zużytą do utleniania glukozy.
Paski diagnostyczne wykorzystujące reakcję oksydazę-oksydazę glukozy i pochodne benzydyny jako chromogen.

Przyjęto trzy metody zunifikowane: metodę titrometryczną Haggedorn-Jensen, metodę orto-toluidynową i o-tolidynową metodę oksydazy glukozowej.

Oznaczanie glukozy metodą orthotoluidine

Zasada

Glukoza po podgrzaniu z ortotołymem w obecności kwasu siarkowego daje niebiesko-zielony kolor.