Rozwój i unifikacja metod analizy i standaryzacji preparatów insuliny za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP HPLC) Pihtar Anatolij Wasiliewicz

• Diagnostyka

Ta rozprawa doktorska powinna trafić do biblioteki w niedalekiej przyszłości.
Powiadamiaj o przyjęciu

Praca dyplomowa - 480 rubli. Dostawa 10 minut, przez całą dobę, siedem dni w tygodniu i święta.

Streszczenie - 240 rubli, dostawa 1-3 godzin, od 10-19 (czasu moskiewskiego), z wyjątkiem niedzieli

Pihtar Anatolij Wasiliewicz. Opracowanie i unifikacja metod analizy i standaryzacji preparatów insuliny za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP HPLC): rozprawa. Kandydat do Nauk Farmaceutycznych: 15.00.02 / Pihtar Anatolij Wasiliewicz; [Miejsce ochrony: Moskiewska Akademia Medyczna "].- Moskwa, 2005.- 139 str.: Il.

Treść rozprawy

ROZDZIAŁ 1. Przegląd literatury 11

1. Rola insuliny w leczeniu cukrzycy 11

2. Biosynteza i biologiczne działanie insuliny 12

3. Ogólna charakterystyka właściwości fizykochemicznych i farmaceutycznych insuliny 15

4. Preparaty insuliny 24

5. Metody produkcji, standaryzacja i kontrola jakości preparatów insuliny 31

6. Zastosowanie HPLC w analizie farmaceutycznej insuliny. 46

ROZDZIAŁ 2. Opis problemu 50

ROZDZIAŁ 3. Badanie wpływu różnych czynników na zachowanie chromatograficzne insuliny w warunkach RP HPLC 56

1. Metody i materiały 57

2. Omówienie wyników 62

2.1. Wpływ składu roztworu buforowego 62

2.2. Wpływ stężenia siarczanu sodu 68

2.3. Wpływ temperatury kolumny chromatograficznej 70

2.4. Wpływ modyfikatora organicznego 75

2.5. Wpływ długości rodnika alkilowego przeszczepionej fazy 80

2.6. Wpływ długości kolumny chromatograficznej 80

ROZDZIAŁ 4. Polepszenie farmakopealnych metod analizy preparatów insuliny na podstawie zastosowania RP HPLC 82

1. Wybór optymalnych warunków dla chromatograficznego oznaczania insuliny i jej zanieczyszczeń w preparatach medycznych 82

2. Metrologiczne właściwości metody 84

3. Zastosowanie opracowanej metodologii testowania oficjalnych preparatów insuliny 95

ROZDZIAŁ 5. Opracowanie metod analizy wstrzykiwanych postaci dawkowania insuliny izofanowej w oparciu o metodę HPLC PF

1. Wybór warunków chromatograficznego oznaczania protaminy w postaciach dawkowania izofanu insuliny 110

2. Badanie profili chromatograficznych protamin izolowanych z różnych gatunków ryb 121

3. Metoda oznaczania protaminy w preparatach izofanu i insuliny 123

4. Walidacja opracowanej metodologii 125

Ogólne wnioski 136

Piśmiennictwo 139

Ogólna charakterystyka właściwości fizykochemicznych i farmaceutycznych insuliny

Z chemicznego punktu widzenia insulina jest małym kulistym białkiem o masie cząsteczkowej do 6000 Da. Jednocześnie należy zauważyć, że insulina jest powszechną nazwą dla całej rodziny homologicznych białek naturalnego i sztucznego pochodzenia o wspólnej charakterystycznej aktywności biologicznej. Białkowy charakter insuliny ustalono w 1928 r. [52]. Jest to jedno z białek, które produkują reakcję biuretową i reakcję Pauliego. Struktura insuliny została w pełni ustalona na początku lat 50-tych. Podstawowy skład chemiczny insuliny różnego pochodzenia charakteryzuje się liczbami podanymi w tabeli 1 [40].

Skład aminokwasowy. Większość cząsteczek insuliny zawiera 51 reszt aminokwasowych, spośród których 17 aminokwasów znajduje się w większości znanych białek.

Charakterystyczną cechą składu aminokwasowego insuliny bydlęcej, świńskiej i ludzkiej jest tryptofan i metionina. Skład aminokwasów tych typów insuliny przedstawiono w tabeli 2 [40,46].

Innym typem insuliny jest zawartość cystyny ​​(6 reszt pół cystyny). Ponadto cząsteczka insuliny wszystkich typów zawiera 6 grup amidowych (asparagina, glutamina).

Po uwolnieniu insuliny, wraz z główną frakcją, można zaobserwować frakcje postaci dezamidowanych insuliny. W środowisku kwaśnym, w procesie dezamidacji, wszystkie 6 grup amidowych można stopniowo odszczepiać, a ruchliwość elektroforetyczna i chromatograficzna zmian insuliny [40]. Tworzenie deamidowanych postaci insuliny można ocenić na podstawie wyników oznaczania amoniaku. W przypadku w pełni amidowej postaci insuliny oznacza się 6 moli amoniaku na 1 mol białka, dla form dezamidowanych wartość ta może wynosić od 5 do 0.

Pierwotna struktura insuliny. Pierwotna struktura insuliny została rozszyfrowana przez grupę Sanger w latach 1945-1955. Poprzez szereg metod chromatograficznych, które pozostawiono do rozdzielenia i identyfikacji różnych peptydów, aminokwasów i ich pochodne, Sanger stanie ustalenia podstawowej struktury insuliny bydlęcej [130,131,132,133,134,135]. Dalsze badania insuliny z różnych źródeł, przy użyciu różnych metod fizyko-chemicznych, w tym metodą Edmana celem ustalenia sekwencji aminokwasowej całego długich peptydów potwierdziło wyniki struktury insuliny Senger i in [BB].

Do tej pory pierwotna struktura insuliny została ustalona u przedstawicieli 24 gatunków należących do 4 klas zwierząt: ssaków, ptaków, ryb i cyclostomów [14]. Trwają badania nad insuliną różnego pochodzenia [71, 772, 73].

Struktura insuliny u różnych zwierząt jest podobna, ale nie identyczna. W swojej pierwotnej strukturze insulina ludzka jest podobna do insuliny wieprzowej, psiej, kaszalotowej i króliczej, różniąc się tylko jednym aminokwasem [40]. Różni się od insuliny bydlęcej trzema aminokwasami. W większym stopniu insulina ludzka nie jest podobna do insuliny świnki morskiej, ptaków i ryb [40]. Różnice w sekwencji aminokwasowej insuliny ludzkiej, świńskiej i bydlęcej przedstawiono w Tabeli 3.

Pomimo różnic strukturalnych wszystkie typy insulin mają podobną aktywność biologiczną, tj. powodować hipoglikemię. Jednakże wartość wykazują aktywność biologiczną w dużym stopniu zależy od gatunku rośliny i jest w zakresie od 11 IU / mg (insulina COD Morza Północnego) i 62 IU / mg (Turcja insuliny i drobiu), przy czym aktywność insuliny ludzkiej jest rzędu 25-30 IU / mg [40]. Im większe różnice międzygatunkowe, tym większa różnica w aktywności biologicznej odpowiedniej insuliny.

Funkcjonalnie aktywna cząsteczka insuliny składa się z dwóch łańcuchów polipeptydowych (łańcuchy A i B) połączonych wiązaniami dwusiarczkowymi; jedno wiązanie jest utworzone przez siódmą resztę aminokwasową obu łańcuchów, drugie wiązanie dwusiarczkowe tworzy 20 reszta łańcucha A i 19 reszt łańcucha B (Figura 2). Ponadto w cząsteczce insuliny znajduje się trzecie wiązanie dwusiarczkowe, które jest wewnątrzłańcuchowe i łączy szóstą i jedenastą resztę łańcucha A [59,117].

Struktura drugorzędna Przy użyciu różnych właściwości fizyko-chemicznych i fizycznych metod wykazano, że cząsteczka insuliny jest wysoce charakterystyczne dla struktury trójwymiarowej (konformację), co przyczynia się do określonych funkcji biologicznych [14]. W cząsteczce natywnej insuliny zarówno cc-helisa jak i p-fold są obecne jednocześnie. Ponadto istnieją obszary o nieuporządkowanej strukturze i strukturze <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Po podgrzaniu, kwasowy roztwór insuliny (pH 2,3-2,5) w temperaturze 100 ° C i szybkie oziębienie do -80 ° C, tak zwanej insuliny włókniste - hormonu całkowicie nieaktywna postać [27]. Dodawanie włókien insuliny fibrylarne w aktywnym roztworze na insulinę powoduje spontaniczne wytrącenie ilościową insuliny w postaci włókienek [14,17].

Metody produkcji, standaryzacja i kontrola jakości preparatów insuliny

Pozyskiwanie zwierzęcych gatunków insuliny. Produkcja przemysłowa insuliny wołowej i wieprzowej została ustanowiona niemal równocześnie w wielu krajach, wkrótce po odkryciu insuliny w 1921 r. [63]. Od tego czasu koncepcja otrzymywania insuliny praktycznie nie uległa zmianie (tabela b) [17, 18]. Surowcami do produkcji zwierzęcych gatunków insuliny są trzustka bydła rzeźnego stosowanego do produkcji żywności.

Najważniejszym zadaniem w produkcji insuliny jest jego czyszczenie - uwalnianie substancji z towarzyszących zanieczyszczeń, które obniżają aktywność biologiczną, powodując reakcję immunologiczną lub potencjalnie niebezpieczne dla zdrowia pacjenta. Na przykład, po kilku latach użytkowania słabo oczyszczone insuliny we krwi pacjenta może wynosić do 5000 jednostek insuliny związany z przeciwciałami. Przeciwciała przeciwko insulinie znacząco wpływają na profil jej działania, a przez to przyczyniają się do nietrwałego przebiegu cukrzycy.

Pierwszą metodą oczyszczania insuliny była rekrystalizacja w obecności soli cynku. W 1945 r. Wykazano, że siedmiokrotna rekrystalizacja insuliny znacznie zmniejsza poziom reakcji alergicznych u pacjentów w porównaniu z oficjalnymi preparatami insuliny w tym czasie [63].

ekstrakcja przeciwprądowa (PE), chromatografia podziałowa (PX), chromatografia jonowymienna (COI) diskelek-troforeza (DEF) i chromatografię wykluczenia molekularnego (GEH) [63] z zastosowaniem liczby próbek insuliny metody niejednorodności po krystalizacji, a pojedynczy pokazuje krystalizacji.

Stwierdzono, że główne zanieczyszczenia są jednocześnie insulinę: proinsuliny, ich związków pośrednich, kowalencyjnych dimerów insuliny, monodezamidoinsulin i monoarginin monoetilinsulin, jak również szereg związków o wysokiej masie cząsteczkowej, nie są naturalne insuliny. Uogólnione wnioski z badań, z uwzględnieniem informacji o aktywności immunologicznej wykryciu zanieczyszczenia, [138], zakończenie jest potrzeba dodatkowego oczyszczania substancji insulinę tak, że metody analizy i DEF GEH wykryte jeden składnik - odpowiednie insuliny.

Aby rozwiązać problem oczyszczania insuliny w 1950 r., Zaproponowano metodę HEC, aw 1970 r. Metodę chromatografii anionowymiennej (AOX). Stwierdzono, że insulina, oczyszczona metodą AOX, zawiera około 500 ppm (części na milion) zanieczyszczeń z aktywnością proinsuliny [137]. Dodatkowe oczyszczanie insuliny za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej na odwróconych fazach (RP HPLC) zmniejsza zawartość frakcji immunogennych do granicy ich wykrycia [63].

Przegląd aktualnych osiągnięć w dziedzinie chromatograficznego oczyszczania insuliny przedstawiono w pracy [96]. Insulina, oczyszczona, sekwencyjnie, z użyciem IOC i GEC, nazywana jest insuliną jednoskładnikową [63]. Uzyskiwanie ludzkiej insuliny. Poszukiwanie metod uzyskiwania ludzkiej insuliny było spowodowane dwoma okolicznościami. Z jednej strony, znaczenie surowego problemu materiałów w przypadku produkcji insuliny zwierzęcej, z drugiej strony - szybki rozwój nauki w tej dziedzinie dał realną możliwość przedstawienia idei w praktyce. W 1979 i 1981 roku prawie równocześnie opracowano dwie metody otrzymywania ludzkiej insuliny - biosyntetyczną i półsyntetyczną [102, 108]. W 1981 roku firma Novo Nordisk po raz pierwszy na świecie rozpoczęła seryjną produkcję ludzkiej półsyntetycznej insuliny. Metoda stosowana przez firmę opiera się na enzymatycznej i chemicznej zamianie Al w cząsteczce insuliny świńskiej z resztą Tre [61]. Ta metoda jest bezpośrednio zależna od uzyskania wymaganej ilości insuliny świńskiej, co zmniejsza jej wartość ekonomiczną. Możliwość uzyskania ludzkiej insuliny metodą biosyntetyczną pojawiła się wraz z rozwojem technologii rekombinacji DNA [10]. Prace nad genetycznie zmodyfikowaną insuliną rozpoczęły się około 25 lat temu. W 1978 r. Stwierdzono, że otrzymano szczep proinsou-ling u szczurów E. coli. W 1979 roku badania Genentecha pozwoliły klonować do E. coli geny kodujące sekwencje aminokwasów. łańcuchów A i B insuliny w galoktozidazny plazmidu p-vklyuchennmi pBR322 porcji [10,102]. W 1981 zsyntetyzowano genu analogu proinsuliny - mini-proinsuliny-C, przy czym 35 wrzodziejące segmentu C-peptydu otrzymuje sześć aminokwasów: Arg-Arg-Gly-Ser-Lys-Arg i przedstawia jej ekspresję w E. coli. W 1982 r. Firma Eli Lilly rozpoczęła pierwszą na świecie przemysłową produkcję insuliny ludzkiej, stosując dwie technologie łańcuchowe opracowane we współpracy z Genentech [102]. Obecnie pokazano możliwość uzyskania ludzkiej insuliny za pomocą różnych układów ekspresyjnych [3,10,101,102]. Z ekonomicznego punktu widzenia istotne znaczenie ma zastosowanie genetycznie zmodyfikowanych szczepów E. coli, bakterii Gram-dodatnich bakterii, z których wiele jest rozpatrywanych superproducer [3]. Jednocześnie osiągnięto znaczny postęp w przypadku komórek drożdży Saccharomices cerevisiae [3,75]. Tabela 7 wymienia główne, wspólne dla różnych metod wytwarzania rekombinowanej insuliny ludzkiej, etapy procesu technologicznego [3,10,63].

Zastosowanie opracowanej metodologii do testowania oficjalnych preparatów insuliny

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) - wariant chromatografii cieczowej na kolumnie, przy czym faza ruchoma - eluent: - wypełnienie kolumny przechodzi przez sorbent z dużą prędkością w wyniku znacznym ciśnieniem (400h105 Pa) na wlocie do kolumny [11].

Jako sposób analizy złożonych mieszanin substancji, HPLC pojawiła się nieco ponad 30 lat temu. Zastosowanie sorbentów o średnicy cząstek 3-10 μm spowodowało gwałtowny wzrost wydajności rozdziału chromatograficznego w porównaniu z klasyczną wersją chromatografii kolumnowej. Dlatego też HPLC jest często określana jako wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC). Cechy instrumentalne stosowania HPLC opisano szczegółowo w licznych podręcznikach [49.50] oraz w odpowiednich sekcjach wiodącej farmakopei [79,150]. W przypadku HPLC opracowano i produkuje się szeroki zakres sorbentów. Według autorów sondażu [51] - około 100 firm na całym świecie produkuje ponad 300 rodzajów nazw sorbentów. Historia, stan obecny i perspektywy rozwoju metody omówiono w opiniach [51] i [77,78].

W różnych wariantach metoda HPLC jest szeroko stosowana w analizie farmaceutycznej (kontrola produkcji i testowanie jakości leku). Metoda znajduje się we wszystkich wiodących farmakopeach świata. Ta metoda jest najdokładniej opisana w Farmakopei Europejskiej i Amerykańskiej. HPLC służy do identyfikacji leków, w celu określenia czystości, składu cząstkowego masy cząsteczkowej i analizy ilościowej. W publikacji US Pharmacopoeia 28 ed. około 30% artykułów prywatnych wymaga użycia HPLC. W European Pharmacopoeia wyd. liczba ta wynosi około 40%.

Pierwszą chromatograficzną metodą testowania insuliny była niskociśnieniowa chromatografia cieczowa wykluczająca żel (GE ZhND). Zasada rozdziału w warunkach HPLC opiera się na różnej zdolności cząsteczek różnej wielkości do penetracji porów neutralnego żelu, który służy jako faza stacjonarna. Średnica hydrodynamiczna monomeru i dimeru insuliny jest proporcjonalna do ich masy cząsteczkowej i wynosi odpowiednio 2,69 i 5,50 nm [115].

W 1967 roku, stosując metodę GE-IHDD, wykazano, że dostępne w handlu preparaty insuliny, oczyszczone przez krystalizację, zawierają zanieczyszczenia o masie cząsteczkowej przekraczającej masę cząsteczkową insuliny [63]. Na chromatogramach świńskiej insuliny znaleziono trzy piki, konwencjonalnie oznaczone jako składniki a-, b- i c. Od tego czasu zaproponowano wiele systemów chromatograficznych do kontrolowania zawartości zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej w preparatach insuliny. Rozdzielanie prowadzi się w silnie pęczniejącego kserożele agarozy (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.), Lub dekstran (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals) użyto jako rozwiązania PD 1-3 M kwasu octowego, [127]. Wysoka czułość tych sorbentów na ściskanie przy ciśnieniach przekraczających ciśnienie pęcznienia matrycy powoduje, że te materiały nie nadają się do pracy w trybie HPLC.

Zastosowanie chromatografii cieczowej wykluczającej żel pod wysokim ciśnieniem (GE HPLC) do analizy insuliny zostało po raz pierwszy opisane w 1980 r., Po opracowaniu twardych makroporowatych sorbentów zgodnych z wodą i wytrzymujących wysokie ciśnienia. W [151] Rozdzielenie prowadzono w kolumnie Protein 1-125-Pak (Waters), żelowych TSK SW 2000 (Toho sodowy Corp.), Bondagel (Pharmacia) w warunkach denaturujących (7 M mocznik mieszaninie roztworu kwasów mineralnych lub jon detergenty). Konieczność analizy insuliny w warunkach denaturujących wiąże się ze zdolnością insuliny do agregacji w roztworze. Do rozdziału insuliny w warunkach HPLC HPLC opisano również zastosowanie "tradycyjnego" eluentu kwasu octowego [152]. Zastosowanie kwasu octowego ma kilka zalet - minimalny wpływ na natywną strukturę wydzielonych związków, dostępność, niski koszt, ponadto ważnym faktem jest zdolność kwasu octowego do tłumienia asocjacji insuliny.

Obecnie GE HPLC jest farmakopealną metodą monitorowania zawartości zanieczyszczeń o wysokiej masie cząsteczkowej w substancjach i gotowych postaciach dawkowania. Metoda służy również do oznaczania zawartości protaminy w preparatach izofanowo-insuliny.

Zastosowanie HPLC na odwróconych fazach (RP HPLC) do oddzielania bydła i świńskiej insuliny po raz pierwszy wykazało wysoką skuteczność tej metody do analizy insulinopodobnych peptydów o podobnej strukturze.

Mechanizm rozdziału białek i polipeptydów w warunkach RP HPLC opiera się na różnej hydrofobowości cząsteczek insuliny i powiązanych zanieczyszczeń. Dotychczas opisano kilkadziesiąt metod chromatograficznego rozdzielania insuliny różnego pochodzenia i ich pochodnych, w tym proinsulin, polipeptydów trzustkowych, pochodnych dezamido, dimeru insuliny. [126] wykazali możliwość oddzielania insuliny z kurczaka, królika, owiec i konia. Oddzielono także insulinę ludzką, wołową i wieprzową. Lloyd i Corran opublikowali metodę oddzielania wołowiny, wieprzowiny, ludzkich insuliny i ich odpowiednich deamidowanych form [104].

Rozdzielanie przeprowadza się na modyfikowanych sorbentach na żelu krzemionkowym, grupach metylowych, butylowych, oktylowych, oktadecylowych i fenylowych w trybie izokratycznym lub gradientowym. Jako PF stosuje się modyfikatory organiczne - acetonitryl, alkohol metylowy, alkohol izopropylowy, zmieszane z wodnymi roztworami buforowymi zawierającymi sole nieorganiczne i odczynniki na bazie jonów. Wykrywanie pików odbywa się głównie metodą spektrofotometryczną przy długości fali 190-220 nm, opisano także metody fluorymetryczne [103].

Analiza substancji i gotowych postaci dawkowania insuliny za pomocą RP HPLC została opisana w prywatnych artykułach w Farmakopei Amerykańskiej i Europejskiej [79, 150]. Metoda służy do testowania leków z określonej grupy pod względem "Autentyczności insuliny", "Pokrewnych białek", "Oznaczenia ilościowego" i "Insuliny w roztworze".

Literatura badawcza opisuje również zastosowanie chromatografii jonowymiennej i powinowactwa do analizy insuliny [44, 102], jednak metody te nie były szeroko stosowane w praktyce farmakopealnej.

Wybór warunków chromatograficznego oznaczania protaminy w postaciach dawek insuliny izofanowej

Zwiększone siły jonowej PF zazwyczaj prowadzi do zwiększenia zdolności insuliny współczynniki, które mogą być spowodowane przez szereg czynników: - zwiększenie stężenia jonów zmniejsza stopień jonizacji naładowanych grup na cząsteczkę białka, zwiększenie jego hydrofobowości / - wysokie stężenie kationów przyczynia ekranowania wolnych grup silanolowych na powierzchni stacjonarnej faza, która osłabia niespecyficzne oddziaływanie elektrostatyczne protonowanych grup aminowych białka z matrycą; - wysoka siła jonowa wpływa na przestrzenną strukturę insuliny, w wyniku czego zmienia się powierzchnia dostępna dla interakcji z sorbentem. Stężenie soli nieorganicznych w FS wpływa na kształt pików i selektywność rozdziału insuliny i insuliny desamido-Asn [143, 144]. Podczas elucji izokratycznej za pomocą sorbentu LiChrosorb Sіv 0,1 M roztwór fosforanu sodu (pH 2,3), zadowalający wynik został osiągnięty tylko przez dodanie siarczanu sodu w roztworze buforowym do uzyskania stężenia 0,1 M. Większość technik analizy insuliny zawiera w farmakopei monografiach, a ND stosować PF na bazie roztworów buforowych o zawartości siarczanu sodu równej 0,2 M. Tak wysoka zawartość siarczanu sodu negatywnie wpływa na powtarzalność wyników chromatografii z powodu stratyfikacji eluentów, ponadto Silnie stężone roztwory soli mają negatywny wpływ na sprzęt chromatograficzny, skracając jego żywotność. Biorąc pod uwagę, że farmakopealne metody analizy opracowano ponad 20 lat temu, interesujące wydaje się zbadanie zachowania chromatograficznego insuliny pod OF-HPLC na chromatograficznych sorbentach najnowszej generacji, w zależności od stężenia siarczanu sodu. Jednocześnie próbowali ustalić, czy redukcja zawartości siarczanu sodu w PF jest dopuszczalna bez znacznego pogorszenia zdolności separacji układu chromatograficznego. W wyniku badań stwierdzono, że wpływ stężenia siarczanu sodu w PF jest różny, w zależności od rodzaju przeszczepionej fazy, a także od gatunku insuliny. Na sorbentach ze szczepionymi grupami C4 i C selektywność oddzielania pików insuliny ludzkiej i insuliny desamido-Asn-ludzki nie zależy od stężenia siarczanu sodu w. roztwór buforowy 1 w zakresie od 0,05 M do 0,2 M. Na sorbencie Diaspher-110-C18 selektywność rozdzielania tej pary pików wynosi maksymalnie 0,05 M, a minimalna 0,1 M (wykres 4). Z drugiej strony, selektywność oddzielania gatunków zwierzęcych insuliny i odpowiadających im desamidowanych postaci AsnA21 nie zależy od siły jonowej roztworu, gdy jest on rozdzielany na sorbencie Diaspher-110-C18. Na sorbencie z grupami szczepionymi C8 selektywność wzrasta od 1,25 do 1,28 przy wzroście stężenia siarczanu sodu (figura 4). Na sorbentu szczepionych grup selektywność rozdzielania C4 w przypadku insuliny wołowej maksymalnej, gdy zostanie wykryta: 0,1 M siarczanu sodu, a minimalne 0,2 M. W przypadku insuliny świńskiej wyraźne maksimum przy stężeniu 0,1 M siarczanu sodu, w tym przypadku zwiększenie jonowe siły doprowadziły do ​​zmniejszenia selektywności separacji (rysunek 4). Liczba skutecznych półek teoretycznych wzrasta wraz ze wzrostem stężenia siarczanu sodu. Wyjątek stanowi zachowanie ludzkiej insuliny na sorbencie Diasfer-110-C8 (rysunek 5). Stopień separacji szczytów insuliny i insuliny desamido-Asn wzrasta wraz ze wzrostem siły jonowej FS, niezależnie od gatunku insuliny i typu fazy szczepionej (schemat b). Zmniejszając stężenie siarczanu sodu z 0,2 M do 0,1 M, stopień separacji wybranej pary szczytów zmniejsza się średnio o 5% dla insuliny ludzkiej i świńskiej oraz o 10% dla insuliny wołowej. Biorąc pod uwagę fakt, że bezwzględna wartość stopnia rozdziału przekracza 2,0, zmierzone pogorszenie zdolności separacji kolumny, naszym zdaniem, nie jest znaczące. W konsekwencji stężenie siarczanu sodu w roztworze buforowym PF można zmniejszyć o 2 razy w porównaniu z farmakopelowymi metodami analizy.

W większości badań nad analizą białek i peptydów rozdział prowadzono w temperaturze pokojowej. Co więcej, niektórzy autorzy wskazują, że wpływ temperatury na selektywność separacji jest minimalny [48]. Jednak wraz ze wzrostem temperatury proces wymiany masy pomiędzy fazą stacjonarną i ruchomą zostaje przyspieszony, co prowadzi do skrócenia czasu retencji peptydów i zwężenia pików.

Insulina jest standaryzowana przez

Trzustka jest jednym z najważniejszych narządów z podwójnym wydzielaniem - wewnętrznym i zewnętrznym.
Produktem wydzielania wewnętrznego jest insulina, która odgrywa ważną rolę w metabolizmie węglowodanów. Insulina jest produktem specjalnego rodzaju komórek zgrupowanych w tak zwane "wyspy" Langerhansa.

Tajemnicą zewnętrzną jest sok trzustkowy zawierający trypsynę - jeden z najważniejszych enzymów trawiennych, który jest wydzielany przez gruczoły tworzące główną masę trzustki. Trypsyna jest główną częścią preparatu pankreatyny.
Insulina (Insulinum). Insulinę wyizolowano w czystej postaci w 1921 roku. Istnieje wiele metod jej wytwarzania, różnią się od siebie głównie szczegółami.

Z uwagi na to, że oprócz insuliny, enzym trypsyna jest zawarta w trzustce, która dość łatwo rozbija insulinę, pierwsze próby uzyskania insuliny z trzustki zawiodły. Dlatego staraliśmy się uzyskać go z gruczołu, w którym ten enzym byłby nieobecny, na przykład z gruczołów rybich lub cieląt wewnątrzmacicznych. Ale nawet te próby osiągnięcia sukcesu produkcyjnego nie były możliwe, ponieważ u ryb rozmiar gruczołów jest bardzo mały, a sam wydalanie gruczołu jest technicznie trudne do wdrożenia; ekstrakcja gruczołów z cieląt wewnątrzmacicznych w dużych ilościach do produkcji stwarza znaczne trudności.
Wreszcie, w 1922 roku eksperymenty z gruczołem dojrzałego bydła wykazały, że przy użyciu zakwaszonego silnego alkoholu enzymy (trypsyna itp.) Są inaktywowane i tracą zdolność niszczenia insuliny.

Schemat technologiczny produkcji. Do produkcji insuliny używa się zamrożonej lub świeżej trzustki głównie od bydła i trzody chlewnej.
Rozdrabnianie. Aby uniknąć zniszczenia hormonu za pomocą trypsyny, świeże gruczoły nie później niż 30 minut po uboju zwierzęcia powinny zostać oczyszczone z sąsiednich tkanek, zmiażdżone w maszynce do mięsa.

Ekstrakcja Rozkruszone gruczoły wlewa się w 95% alkoholu, zakwasza się kwasem siarkowym (1 część dławika to 1,5 części alkoholu 95 ° bez aldehydów + 0,5% kwasu siarkowego lub chlorowodorowego). Mieszaninę ekstrahuje się chłodzeniem przez 1,5 godziny, stale mieszając.
Pierwszy ekstrakt odsącza się, pozostałość wykręca lub odwirowuje. Ekstrakcję ponownie ekstrahuje się 1 godzinę 60 ° alkoholem (a nie 95 °, ponieważ w surowcu nie ma wilgoci) - jedna część gruczołu zajmuje jedną część alkoholu. Oba ekstrakty są spuszczane razem i filtrowane przez arkusz.

Usuwanie białek balastowych. Z otrzymanego ekstraktu białka są usuwane na różne sposoby:
1) przez osiadanie w zimnie (od -4 do 0 ° С) w ciągu 48 godzin.
2) dodać roztwór wodorotlenku sodu do ekstraktu do pH 6,6 - 6,8 (w niektórych przypadkach - do pH = 6,4 - 6,6).

Strącanie oddziela się za pomocą wirówki, filtracji lub sedymentacji.
Odparowanie i odtłuszczenie. Otrzymany klarowny płyn zakwasza się czystym kwasem siarkowym do pH = 2,5 i poddaje odparowaniu do 1/10 objętości w temperaturze nie wyższej niż 40 ° C.
Po usunięciu całego alkoholu ciecz jest odtłuszczana.

Solenie i czyszczenie. Siarczan amonu dodaje się do odtłuszczonego przesączu do nasycenia, po czym wydziela się insulina z niewielką ilością substancji balastowych, tworząc skorupkę insuliny surowej, którą usuwa się i suszy, a następnie odtłuszcza za pomocą mieszaniny alkohol-eter.
Odtłuszczoną insulinę suszy się w warunkach otoczenia i miele na proszek. Proszki wykwitów poddaje się dalszemu oczyszczaniu w celu uzyskania krystalicznej insuliny zawierającej co najmniej 22 U w 1 mg.
Standaryzacja. Otrzymana insulina jest białym lub lekko szarawym proszkiem. Jest rozpuszczalny w wodzie i w wodnym roztworze alkoholu do 80 °, ale nierozpuszczalny w alkoholu z fortecą powyżej 90 °. Po rozpuszczeniu insuliny w wodzie otrzymuje się bezbarwną lub lekko żółtawą ciecz.

Do konserwacji dodano 0,3% tricresolu lub fenolu do roztworu i poddano normalizacji biologicznej. Po wstrzyknięciu insuliny królikom, ich zawartość węglowodanów we krwi od 1,5 do 5 godzin powinna zmniejszyć się średnio o 50%, tj. Z 0,09 do 0,045% (patrz: Farmakopeja, wydanie dziewiąte). Odpowiednia dawka jest nazywana jedną jednostką królika, która jest równa trzem ludziom lub trzem klinicznym.
Opakowanie Roztwór przepuszcza się przez filtr bakteryjny. Następnie przesącz wylewa się w warunkach aseptycznych do butelek o objętości 5 lub 10 ml w każdym mililitrze roztworu insuliny o objętości 40 lub 80 j.

Fiolki są zamknięte gumowymi korkami, które są nawijane aluminiowymi kapslami.
Etykiety umieszcza się na butelkach i na pudełku z butelkami, na których należy wskazać czynności przygotowania, datę produkcji, okres przydatności do spożycia itp.

Przed użyciem insuliny, aluminiowa nakrywka jest otwierana, wycierana alkoholem, następnie korek nakłuwany jest sterylną igłą, a wymagana ilość płynu zostaje zassana do strzykawki, która jest wstrzykiwana podskórnie lub domięśniowo.
Przechowywanie Insulina jest przechowywana w fiolkach. Okres ważności wynosi 18 miesięcy w temperaturze nie wyższej niż 10 ° C, ponieważ w wyższej temperaturze insulina może częściowo stracić aktywność.

Zewnętrzne oznaki nieprzydatności: zmętnienie roztworu lub opadów atmosferycznych, pojawienie się pleśni wewnątrz fiolek lub kolonii mikroorganizmów.

Grupa farmakologiczna - Insuliny

Przygotowania do podgrup są wykluczone. Włącz

Opis

Insulina (z łaciny, Insula - islet) to hormon białkowo-peptydowy wytwarzany przez komórki β wysepek trzustkowych Langerhansa. W warunkach fizjologicznych wytwarza się insulinę komórek β z preproinsuliny, jednołańcuchowego białka prekursorowego składającego się z 110 reszt aminokwasowych. Po przeniesieniu szorstkiej retikulum endoplazmatycznego przez błonę, 24-aminokwasowy peptyd sygnałowy odszczepia się z preproinsuliny i tworzy się proinsulina. Długi łańcuch proinsuliny w aparacie Golgiego jest pakowany w granulki, gdzie w wyniku hydrolizy cztery główne reszty aminokwasowe są rozdzielane w celu utworzenia insuliny i C-końcowego peptydu (fizjologiczna funkcja peptydu C jest nieznana).

Cząsteczka insuliny składa się z dwóch łańcuchów polipeptydowych. Jeden z nich zawiera 21 reszt aminokwasowych (łańcuch A), drugi - 30 reszt aminokwasowych (łańcuch B). Łańcuchy są połączone dwoma mostkami dwusiarczkowymi. Trzeci mostek disulfidowy tworzy się wewnątrz łańcucha A. Całkowita masa cząsteczkowa cząsteczki insuliny wynosi około 5700. Sekwencję aminokwasową insuliny uważa się za konserwatywną. Większość gatunków ma jeden gen insuliny, który koduje jedno białko. Wyjątkiem są szczury i myszy (mają dwa geny insuliny), produkują dwie insuliny, różniące się dwiema resztami aminokwasowymi łańcucha B.

Pierwotna struktura insuliny u różnych gatunków biologicznych, w tym. i u różnych ssaków, nieco inaczej. Najbliżej struktury ludzkiej insuliny jest insulina wieprzowa, która różni się od ludzkiej jedną aminokwasem (zawiera łańcuch A zamiast reszty aminokwasowej reszta treoniny alaniny). Insulina bydlęca różni się od ludzkiej trzema resztami aminokwasowymi.

Tło historyczne. W 1921 r. Frederick G. Banting i Charles G. Best, pracujący w laboratorium Johna J. R. McLeoda na Uniwersytecie w Toronto, wyodrębnili wyciąg z trzustki (jak później okazało się zawierać amorficzną insulinę), co obniżyło poziom glukozy we krwi u psów z eksperymentalną cukrzycą. W 1922 r. Do pierwszego pacjenta, 14-letniego Leonarda Thompsona, który choruje na cukrzycę, wstrzyknięto ekstrakt z trzustki, co uratowało mu życie. W 1923 r. James B. Collip opracował metodę oczyszczania wyciągu ekstrahowanego z trzustki, która później umożliwiła przygotowanie aktywnych ekstraktów z gruczołów trzustkowych trzody chlewnej i bydła, które dają powtarzalne wyniki. W 1923 Banting i McLeod zostali nagrodzeni Nagrodą Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny za odkrycie insuliny. W 1926 r. J. Abel i V. Du-Vigno otrzymali insulinę w postaci krystalicznej. W 1939 r. Insulina została po raz pierwszy zatwierdzona przez FDA (Food and Drug Administration). Frederick Sanger całkowicie odszyfrował sekwencję aminokwasową insuliny (1949-1954) W 1958 roku Sanger otrzymał Nagrodę Nobla za swoją pracę nad rozszyfrowaniem struktury białek, szczególnie insuliny. W 1963 roku syntetyzowano sztuczną insulinę. Pierwsza rekombinowana insulina ludzka została zatwierdzona przez FDA w 1982 roku. Analogi insuliny o ultraszybkiej aktywności (insulina lispro) zostały zatwierdzone przez FDA w 1996 roku.

Mechanizm działania. W realizacji efektów insuliny główną rolę odgrywają interakcje ze specyficznymi receptorami zlokalizowanymi na błonie komórkowej komórki oraz tworzenie kompleksu receptor-receptor. W połączeniu z receptorem insuliny insulina wchodzi do komórki, gdzie wpływa na fosforylację białek komórkowych i wywołuje liczne reakcje wewnątrzkomórkowe.

U ssaków receptory insuliny znajdują się na prawie wszystkich komórkach, zarówno na klasycznych komórkach docelowych insuliny (hepatocytach, miocytach, lipocytach), jak i na krwinkach, gruczołach mózgu i płci. Liczba receptorów w różnych komórkach mieści się w zakresie od 40 (erytrocytów) do 300 tysięcy (hepatocytów i lipocytów). Receptor insuliny jest ciągle syntetyzowany i rozkładany, jego okres półtrwania wynosi 7-12 godzin.

Receptor insuliny jest dużą transbłonową glikoproteiną składającą się z dwóch podjednostek a o masie cząsteczkowej 135 kDa (każda zawiera 719 lub 731 reszt aminokwasowych w zależności od składania mRNA) i dwóch podjednostek β o masie cząsteczkowej 95 kDa (620 reszt aminokwasowych). Podjednostki są wzajemnie połączone wiązaniami dwusiarczkowymi i tworzą strukturę heterotetrameryczną β-α-α-β. Podjednostki alfa są zlokalizowane pozakomórkowo i zawierają miejsca wiążące insulinę, które są rozpoznawalną częścią receptora. Podjednostki beta tworzą domenę transbłonową, posiadają aktywność kinazy tyrozynowej i spełniają funkcję konwersji sygnału. Wiązanie insuliny z podjednostką α receptora insuliny prowadzi do stymulacji aktywności kinazy tyrozynowej podjednostek β przez autofosforylację ich reszt tyrozynowych, następuje agregacja α, β-heterodimerów i szybka internalizacja kompleksów hormon-receptor. Aktywowany receptor insuliny rozpoczyna kaskadę reakcji biochemicznych, w tym. fosforylacja innych białek w komórce. Pierwszą z tych reakcji jest fosforylacja czterech białek, zwanych substratami receptora insuliny (substrat receptora insuliny), IRS-1, IRS-2, IRS-3 i IRS-4.

Farmakologiczne działanie insuliny. Insulina atakuje praktycznie wszystkie narządy i tkanki. Jednak jego głównymi celami są wątroba, mięśnie i tkanka tłuszczowa.

Insulina endogenna jest najważniejszym regulatorem metabolizmu węglowodanów, egzogenna insulina jest specyficznym czynnikiem redukującym cukier. Wpływ insuliny na metabolizm węglowodanów wynika z faktu, że zwiększa transport glukozy przez błonę komórkową i jej wykorzystanie przez tkanki, przyczynia się do konwersji glukozy do glikogenu w wątrobie. Insulina dodatkowo hamuje endogenne wytwarzanie glukozy poprzez hamowanie glikogenolizy (rozpad glikogenu na glukozę) i glukoneogenezę (syntezę glukozy ze źródeł innych niż węglowodanowe - na przykład z aminokwasów, kwasów tłuszczowych). Oprócz hipoglikemii insulina ma wiele innych efektów.

Wpływ insuliny na metabolizm tłuszczu przejawia się w hamowaniu lipolizy, co prowadzi do zmniejszenia przepływu wolnych kwasów tłuszczowych do krwioobiegu. Insulina zapobiega powstawaniu ciał ketonowych w ciele. Insulina zwiększa syntezę kwasów tłuszczowych i ich późniejszą estryfikację.

Insulina bierze udział w metabolizmie białek: zwiększa transport aminokwasów przez błonę komórkową, stymuluje syntezę peptydów, zmniejsza zużycie białka przez tkanki i hamuje konwersję aminokwasów do ketokwasów.

Aktywności insuliny towarzyszy aktywacja lub hamowanie szeregu enzymów: stymulowana jest synteza glikogenu, dehydrogenaza pirogronianowa, heksokinaza, hamowane są lipazy (i hydrolizujące lipidy tkanki tłuszczowej i lipaza lipoproteinowa, które zmniejszają zmętnienie surowicy po spożyciu pokarmów o wysokiej zawartości tłuszczu).

W fizjologicznej regulacji biosyntezy i wydzielania insuliny przez trzustkę główną rolę odgrywa stężenie glukozy we krwi: wraz ze wzrostem jej zawartości zwiększa się wydzielanie insuliny, a wraz ze spadkiem - spowalnia. Na wydzielanie insuliny, oprócz glukozy, wpływają elektrolity (zwłaszcza jony Ca 2+), aminokwasy (w tym leucyna i arginina), glukagon, somatostatyna.

Farmakokinetyka. Preparaty insuliny wstrzykuje się s / c, domięśniowo lub dożylnie (w / in, podawane są tylko insuliny krótkodziałające i tylko w cukrzycowej wrzodziejącej i śpiączce). Nie można wprowadzić / zawiesić insuliny. Temperatura insuliny powinna być w temperaturze pokojowej, ponieważ zimna insulina jest wchłaniana wolniej. Najbardziej optymalnym sposobem ciągłej insulinoterapii w praktyce klinicznej jest sc. Wprowadzenie.

Pełne wchłanianie i początek działania insuliny zależą od miejsca wstrzyknięcia (zwykle insulina jest wstrzykiwana do jamy brzusznej, ud, pośladków, ramion), dawki (objętość wstrzykniętej insuliny), stężenia insuliny w preparacie itd.

Szybkość wchłaniania insuliny do krwi z miejsca wstrzyknięcia zależy od wielu czynników - takich jak insulina, miejsce wstrzyknięcia, miejscowe natężenie przepływu krwi, miejscowa aktywność mięśni, ilość wstrzykniętej insuliny (nie więcej niż 12-16 U leku zaleca się wstrzykiwanie w jednym miejscu). Najszybciej insulina dostaje się do krwi z tkanki podskórnej przedniej ściany jamy brzusznej, wolniej od barku, przedniej powierzchni uda, a nawet wolniej od podskapuli i pośladków. Wynika to ze stopnia unaczynienia podskórnej tkanki tłuszczowej na wymienionych obszarach. Profil działania insuliny podlega znacznym wahaniom u różnych osób i tej samej osoby.

We krwi insulina wiąże się z alfa i beta globulinami, zwykle 5-25%, ale wiązanie może wzrosnąć podczas leczenia z powodu pojawienia się przeciwciał w surowicy (wytwarzanie przeciwciał przeciwko egzogennej insulinie prowadzi do oporności na insulinę, przy użyciu nowoczesnych wysoce oczyszczonych preparatów rzadko występuje insulinooporność ). T_1/2 krwi jest mniej niż 10 minut. Większość insuliny uwalnianej do krwioobiegu ulega rozkładowi proteolitycznemu w wątrobie i nerkach. Jest szybko wydalany przez nerki (60%) i wątrobę (40%); mniej niż 1,5% jest wydalane z moczem w postaci niezmienionej.

Obecnie stosowane preparaty insuliny różnią się na wiele sposobów, w tym według źródła pochodzenia, czasu działania, pH roztworu (kwaśny i obojętny), obecności środków konserwujących (fenol, krezol, fenol-krezol, paraben metylowy), stężenia insuliny - 40, 80, 100, 200, 500 U / ml.

Klasyfikacja. Insuliny są zazwyczaj klasyfikowane według pochodzenia (bydła, świń, ludzi, a także analogów insuliny ludzkiej) i czasu działania.

W zależności od źródeł produkcji wyróżnia się insuliny pochodzenia zwierzęcego (głównie preparaty insuliny wieprzowej), półsyntetyczne preparaty ludzkiej insuliny (otrzymywane z insuliny wieprzowej przez transformację enzymatyczną), preparaty ludzkiej insuliny (rekombinowane DNA, produkowane przez inżynierię genetyczną).

Do użytku medycznego insulina była wcześniej otrzymywana głównie z trzustki bydła, a następnie z gruczołów trzustkowych trzody chlewnej, ponieważ insulina świńska jest bliżej ludzkiej insuliny. Ponieważ insulina bydlęca, która różni się od ludzkich trzech aminokwasów, często powoduje reakcje alergiczne, obecnie praktycznie nie jest stosowana. Świńska insulina, która różni się od człowieka jednym aminokwasem, rzadziej powoduje reakcje alergiczne. W preparatach insulinowych, jeśli nie ma wystarczającego oczyszczenia, mogą być obecne zanieczyszczenia (proinsulina, glukagon, somatostatyna, białka, polipeptydy), które mogą powodować różne reakcje uboczne. Nowoczesne technologie umożliwiają otrzymanie oczyszczonego (chromatograficznie oczyszczonego piku piku z uwolnieniem "piku" insuliny), wysoce oczyszczonego (mono-składnikowego) i skrystalizowanego preparatu insuliny. W przypadku preparatów insuliny pochodzenia zwierzęcego, preferowana jest insulina z pojedynczym szczytem pochodząca z trzustki świń. Insulina uzyskana dzięki inżynierii genetycznej jest w pełni zgodna z składem aminokwasowym ludzkiej insuliny.

Aktywność insuliny określa się metodą biologiczną (zgodnie z jej zdolnością do obniżania poziomu glukozy we krwi u królików) lub metodą fizykochemiczną (przez elektroforezę na papierze lub chromatografię na papierze). W przypadku jednej jednostki działania lub jednostki międzynarodowej należy przyjąć 0,04082 mg krystalicznej insuliny. Ludzka trzustka zawiera do 8 mg insuliny (około 200 U).

Preparaty insuliny są podzielone na krótkie i ultrakrótkie leki - imitują normalne fizjologiczne wydzielanie insuliny przez trzustkę w odpowiedzi na stymulację, leki o średnim czasie trwania i długo działające leki - imitują podstawowe (podstawowe) wydzielanie insuliny, a także łączone leki (łączą oba działania).

Istnieją następujące grupy:

Ultrakrótkie insuliny (działanie hipoglikemiczne rozwija się 10-20 minut po wstrzyknięciu s / c, szczyt działania osiąga się przeciętnie po 1-3 godzinach, czas działania wynosi 3-5 godzin):

- insulina lispro (Humalog);

- insulin aspart (NovoRapid Penfill, NovoRapid FlexPen);

- insulina glulizynowa (apidra).

Insuliny krótkodziałające (początek działania zwykle po 30-60 minutach, maksymalne działanie po 2-4 godzinach, czas działania do 6-8 godzin):

- insulina rozpuszczalna [ludzka inżynieria genetyczna] (Actrapid HM, Gensulin R, Rinsulin R, Humulin Regular);

- insulina rozpuszczalna [ludzka półsyntetyczna] (Biogulin R, Humodar R);

- insulina rozpuszczalna [monokomponent świński] (Actrapid MS, Monodar, Monosuinsulin MK).

Długodziałające preparaty insuliny - obejmują leki o średnim czasie działania i leki długo działające.

Insuliny o średnim czasie działania (początek po 1,5-2 godzinach, pik po 3-12 godzinach, czas trwania 8-12 godzin):

- Insulina-izofan [ludzka inżynieria genetyczna] (Biosulin N, Gansulin N, Gensulin N, Insuman Bazal GT, Insuran NPH, Protafan NM, Rinsulin NPH, Humulin NPH);

- insulino-izofan [ludzki półsyntetyczny] (Biogulin N, Humodar B);

- insulin-izofan [monokomponent świni] (Monodar B, Protafan MS);

- zawiesina związku cynkowego insuliny (Monotard MS).

Insuliny długo działające (początek po 4-8 godz., Szczyt po 8-18 godz., Całkowity czas trwania 20-30 godz.):

- insulina glargine (Lantus);

- insulina detemir (Levemir Penfill, Levemir FlexPen).

Połączone preparaty insuliny (leki dwufazowe) (działanie hipoglikemiczne rozpoczyna się 30 minut po podaniu c / s, osiąga maksimum po 2-8 godzinach i utrzymuje się do 18-20 godzin):

- insulina dwufazowa [ludzka półsyntetyczna] (Biogulin 70/30, Humodar K25);

- insulina dwufazowa [modyfikowana genetycznie] (Gansulin 30P, Gensulin M 30, Insuman Comb 25 GT, Mikstaard 30 NM, Humulin M3);

- insulina aspart dwufazowa (Novomix 30 Penfill, Novomix 30 FlexPen).

Ultrakrótkie insuliny są analogami insuliny ludzkiej. Wiadomo, że endogenna insulina w komórkach β trzustki, a także cząsteczki hormonów w wytwarzanych roztworach insuliny krótkodziałającej są polimeryzowane i stanowią heksamery. Podczas podawania s / c formy heksameryczne są wchłaniane powoli, a szczytowe stężenie hormonu we krwi, podobnie jak u zdrowej osoby po jedzeniu, jest niemożliwe do wytworzenia. Pierwszym krótkodziałającym analogiem insuliny, który jest wchłaniany z tkanki podskórnej 3 razy szybciej niż insulina ludzka, była insulina lispro. Insulina lispro jest pochodną ludzkiej insuliny uzyskaną przez zamianę dwóch reszt aminokwasowych w cząsteczce insuliny (lizyna i prolina w pozycjach 28 i 29 łańcucha B). Modyfikacja cząsteczki insuliny zakłóca tworzenie się heksamerów i zapewnia szybki przepływ leku do krwi. Niemal natychmiast po wstrzyknięciu s / c w tkankach cząsteczki insuliny lispro w postaci heksamerów szybko dysocjują w monomery i dostają się do krwi. Kolejny analog insuliny - insulina aspart - został stworzony przez zastąpienie proliny w pozycji B28 ujemnie naładowanym kwasem asparaginowym. Podobnie jak insulina lispro, po iniekcji sc, szybko rozpada się na monomery. W insulinie glulizynowej zastąpienie insuliny ludzkiej aminokwasu asparaginy w pozycji B3 dla lizyny i lizyny w pozycji B29 dla kwasu glutaminowego również przyczynia się do szybszej absorpcji. Ultrakrótkie analogi insuliny można podawać bezpośrednio przed posiłkiem lub po posiłku.

Krótko działające insuliny (zwane również rozpuszczalnymi) są roztworami w buforze o neutralnych wartościach pH (6,6-8,0). Są przeznaczone do podawania podskórnego, rzadziej - domięśniowo. Jeśli to konieczne, są również podawane dożylnie. Mają szybki i stosunkowo krótki efekt hipoglikemiczny. Efekt po wstrzyknięciu podskórnym występuje po 15-20 minutach, osiąga maksimum po 2 godzinach; całkowity czas działania wynosi około 6 godzin, są one stosowane głównie w szpitalu podczas ustalania dawki insuliny niezbędnej dla pacjenta, a także, gdy wymagany jest szybki (pilny) efekt - w śpiączce cukrzycowej i prekomacie. Z / we wprowadzeniu T_1/2 sprawia, że ​​przez 5 minut w cukrzycowej śpiączce ketonowej podawana jest insulina w kroplówce. Preparaty insuliny o krótkim czasie działania są również stosowane jako środki anaboliczne i są zazwyczaj przepisywane w małych dawkach (4-8 jm 1-2 razy dziennie).

Insuliny o średnim czasie działania są mniej rozpuszczalne, są wolniej absorbowane z tkanki podskórnej, w wyniku czego mają dłuższy efekt. Przedłużone działanie tych leków osiąga się dzięki obecności specjalnego przedłużacza - protaminy (izofanu, protaphanu, podstawy) lub cynku. Spowolnienie wchłaniania insuliny w preparatach zawierających zawiesinę insuliny cynkowej ze względu na obecność kryształów cynku. Insulina NPH (neutralna protamina Hagedorn lub izofan) jest zawiesiną składającą się z insuliny i protaminy (protamina jest białkiem wyizolowanym z mleka rybnego) w stosunku stechiometrycznym.

Insuliny długo działające obejmują insulinę glargine - analog insuliny ludzkiej, uzyskaną za pomocą technologii rekombinacji DNA - pierwszego leku insulinowego, który nie wykazuje wyraźnego szczytu działania. Insulina glargine jest otrzymywana przez dwie modyfikacje cząsteczki insuliny: zastąpienie łańcucha A (asparaginą) glicyną w pozycji 21 i przyłączenie dwóch reszt argininy do C-końca łańcucha B. Lek jest klarownym roztworem o pH 4. Kwaśne pH stabilizuje heksamery insuliny i zapewnia długą i przewidywalną absorpcję leku z tkanki podskórnej. Jednak ze względu na kwaśne pH insuliny glargine nie można łączyć z insulinami krótkodziałającymi, które mają obojętne pH. Pojedyncze wstrzyknięcie insuliny glargine zapewnia całodobową kontrolę glikemiczną poza szczytem. Większość preparatów insuliny ma tzw. "Szczyt" działania, odnotowany, kiedy stężenie insuliny we krwi osiąga maksimum. Insulina glargine nie ma wyraźnego piku, ponieważ jest uwalniana do krwioobiegu we względnie stałym tempie.

Preparaty insuliny o przedłużonym działaniu są dostępne w różnych postaciach dawkowania, które mają działanie hipoglikemiczne o różnym czasie trwania (od 10 do 36 godzin). Wydłużony efekt zmniejsza liczbę codziennych iniekcji. Zwykle wytwarza się je w postaci zawiesin, podawanych tylko podskórnie lub domięśniowo. W stanie śpiączki cukrzycowej i stanu przed-śpiączkowego nie stosuje się długotrwałych leków.

Połączone preparaty insuliny są zawiesinami składającymi się z obojętnej, rozpuszczalnej insuliny krótkodziałającej i insuliny-izofanu (średni czas działania) w pewnych proporcjach. Ta kombinacja insuliny o różnym czasie działania w jednym preparacie pozwala pacjentowi zaoszczędzić na dwóch wstrzyknięciach przy oddzielnym stosowaniu leków.

Wskazania. Głównym wskazaniem do stosowania insuliny jest cukrzyca typu 1, ale w pewnych warunkach jest ona również zalecana w przypadku cukrzycy typu 2, w tym. z opornością na doustne środki hipoglikemizujące, z ciężkimi współistniejącymi chorobami, w przygotowaniu do interwencji chirurgicznych, śpiączki cukrzycowej, z cukrzycą u kobiet w ciąży. Insuliny krótkodziałające stosuje się nie tylko w cukrzycy, ale także w innych procesach patologicznych, na przykład w ogólnym wyczerpaniu (jako środek anaboliczny), w leczeniu chorób tarczycy (atonia, gastroptoza), przewlekłego zapalenia wątroby i pierwotnych postaci marskości wątroby jak również w niektórych chorobach psychicznych (podawanie dużych dawek insuliny - tzw. śpiączka hipoglikemiczna); jest czasem stosowany jako składnik "polaryzujących" roztworów stosowanych w leczeniu ostrej niewydolności serca.

Insulina jest głównym specyficznym leczeniem cukrzycy. Leczenie cukrzycy odbywa się zgodnie ze specjalnie opracowanymi programami z użyciem preparatów insuliny o różnym czasie działania. Wybór leku zależy od ciężkości i charakterystyki przebiegu choroby, ogólnego stanu pacjenta i szybkości wystąpienia oraz czasu trwania działania leku obniżającego cukier.

Wszystkie preparaty insuliny są stosowane pod warunkiem bezwzględnego przestrzegania reżimu żywieniowego z ograniczeniem wartości energetycznej żywności (od 1700 do 3 000 kcal).

Określając dawkę insuliny, kieruje się nią poziom glukozy na czczo iw ciągu dnia, a także poziom glukozurii w ciągu dnia. Ostateczną selekcję dawki przeprowadza się pod kontrolą redukcji hiperglikemii, glikozurii, jak również ogólnego stanu pacjenta.

Przeciwwskazania. Insulina jest przeciwwskazana w chorobach i stanach, które występują z hipoglikemią (na przykład insulinoma), w ostrych chorobach wątroby, trzustki, nerek, wrzodów żołądka i dwunastnicy, zdekompensowanych wad serca, w ostrej niewydolności wieńcowej i niektórych innych chorobach.

Stosuj podczas ciąży. Głównym lekiem stosowanym w leczeniu cukrzycy w czasie ciąży jest insulinoterapia prowadzona pod ścisłym nadzorem. W przypadku cukrzycy typu 1 kontynuowane jest leczenie insuliną. W przypadku cukrzycy typu 2 doustne leki hipoglikemizujące są anulowane, a terapia dietetyczna jest przeprowadzana.

Cukrzyca ciążowa (cukrzyca ciężarna) jest zaburzeniem metabolizmu węglowodanów, które wystąpiło po raz pierwszy w czasie ciąży. Cukrzyca ciążowa wiąże się ze zwiększonym ryzykiem śmierci okołoporodowej, występowaniem wrodzonych wad rozwojowych, a także ryzykiem progresji cukrzycy w okresie 5-10 lat po porodzie. Leczenie cukrzycy ciążowej rozpoczyna się od diety. Jeśli dieta jest nieskuteczna, stosuje się insulinę.

W przypadku pacjentów z cukrzycą występującą wcześniej lub z cukrzycą ciążową ważne jest utrzymanie odpowiedniej regulacji procesów metabolicznych podczas ciąży. Zapotrzebowanie na insulinę może zmniejszyć się w pierwszym trymestrze ciąży i wzrosnąć w drugim i trzecim trymestrze ciąży. Podczas porodu i bezpośrednio po nim zapotrzebowanie na insulinę może dramatycznie zmniejszyć się (zwiększa się ryzyko hipoglikemii). W tych warunkach niezbędne jest dokładne monitorowanie stężenia glukozy we krwi.

Insulina nie przenika przez barierę łożyskową. Jednak przeciwciała IgG matki przeciwko insulinie przechodzą przez łożysko i prawdopodobnie powodują hiperglikemię u płodu przez neutralizowanie wydzielanej z niej insuliny. Z drugiej strony, niepożądana dysocjacja kompleksów insulina - przeciwciało może prowadzić do hiperinsulinemii i hipoglikemii u płodu lub noworodka. Wykazano, że przejściu od preparatów insuliny wołowej / świńskiej do preparatów jednoskładnikowych towarzyszy spadek miana przeciwciał. W związku z tym w czasie ciąży zaleca się stosowanie wyłącznie preparatów insuliny ludzkiej.

Analogi insuliny (podobnie jak inne nowo opracowane czynniki) są przepisywane z ostrożnością podczas ciąży, chociaż nie ma wiarygodnych dowodów na negatywne skutki. Zgodnie z ogólnie przyjętymi zaleceniami FDA (Food and Drug Administration), które określają możliwość stosowania leków podczas ciąży, preparaty insuliny wpływające na płód należą do kategorii B (badanie reprodukcji na zwierzętach nie wykazało niekorzystnego wpływu na płód oraz odpowiednie i ściśle kontrolowane badania u kobiet w ciąży kobiety nie były prowadzone) lub do kategorii C (badania rozrodczości na zwierzętach ujawniły niekorzystny wpływ na płód, a odpowiednie i dobrze kontrolowane badania u ciężarnych nie zostały przeprowadzone, ale potencjalne korzyści związane ze stosowaniem leków u kobiet w ciąży mogą usprawiedliwiać ich stosowanie, pomimo możliwego ryzyka). Tak więc insulina lizpro należy do klasy B, a insulina aspart i insulina glargine - do klasy C.

Powikłania insulinoterapii. Hipoglikemia. Wprowadzenie zbyt wysokich dawek, jak również brak spożycia węglowodanów z pożywieniem może powodować niepożądany stan hipoglikemii, śpiączka hipoglikemiczna może rozwijać się z utratą przytomności, drgawkami i depresją czynności serca. Hipoglikemia może również rozwinąć się z powodu działania dodatkowych czynników, które zwiększają wrażliwość na insulinę (na przykład niewydolność kory nadnerczy, niedoczynność przysadki) lub zwiększają wchłanianie glukozy przez tkankę (ćwiczenia).

Wczesne objawy hipoglikemii, która jest w dużej mierze związane z aktywacją współczulnego układu nerwowego (objawy adrenergiczne) obejmują tachykardię, zimne poty, drżenie, z aktywacją układu przywspółczulnego - silny głód, nudności i mrowienie warg i języka. Przy pierwszych oznakach hipoglikemii należy podjąć pilne środki: pacjent powinien pić słodką herbatę lub zjeść kilka kostek cukru. W śpiączce hipoglikemicznej 40% roztwór glukozy w ilości 20-40 ml lub więcej wstrzykuje się do żyły, aż pacjent opuści stan śpiączki (zwykle nie więcej niż 100 ml). Hipoglikemię można również usunąć domięśniowym lub podskórnym podawaniem glukagonu.

Zwiększenie masy ciała podczas insulinoterapii wiąże się z eliminacją glukozurii, wzrostem faktycznej wartości kalorycznej żywności, wzrostem apetytu i stymulacją lipogenezy pod wpływem insuliny. Jeśli postępujesz zgodnie z zasadami żywienia, ten efekt uboczny można uniknąć.

Stosowanie nowoczesnych wysoce oczyszczonych leków hormonalnych (zwłaszcza preparatów insuliny ludzkiej modyfikowanych genetycznie) stosunkowo rzadko prowadzi do rozwoju insulinooporności i alergii, ale takie przypadki nie są wykluczone. Rozwój ostrej reakcji alergicznej wymaga natychmiastowej terapii odczulającej i zastąpienia leku. Rozwijając reakcję na preparaty insuliny bydlęcej / świńskiej, należy je zastąpić preparatami insuliny ludzkiej. Reakcje miejscowe i ogólnoustrojowe (świąd, miejscowa lub ogólnoustrojowa wysypka, tworzenie guzków podskórnych w miejscu wstrzyknięcia) są związane z niewystarczającym oczyszczaniem insuliny z zanieczyszczeń lub z użyciem insuliny bydlęcej lub świńskiej, które różnią się sekwencją aminokwasów od człowieka.

Najczęstsze reakcje alergiczne to skóry, w których pośredniczą przeciwciała IgE. Sporadycznie obserwuje się ogólnoustrojowe reakcje alergiczne, a także insulinooporność, w której pośredniczą przeciwciała IgG.

Niewyraźne widzenie Przejściowe zaburzenia refrakcji oka występują na samym początku leczenia insuliną i znikają same w ciągu 2-3 tygodni.

Obrzęk. W pierwszych tygodniach leczenia przejściowy obrzęk nóg występuje również z powodu zatrzymania płynów, tzw. obrzmienie insuliny.

Reakcje miejscowe obejmują lipodystrofię w miejscu powtarzanych wstrzyknięć (rzadkie powikłanie). Przydzielanie lipoatrofii (zanik osadów tłuszczu podskórnego) i lipohipertrofii (zwiększone odkładanie tłuszczu podskórnego). Te dwa państwa mają inny charakter. Lipoatrofilia - reakcja immunologiczna, głównie ze względu na podawanie słabo oczyszczonych preparatów insuliny pochodzenia zwierzęcego, obecnie praktycznie nie występuje. Lipohipertrofia rozwija się przy użyciu wysoko oczyszczonych preparatów insuliny ludzkiej i może wystąpić, jeśli technika wstrzykiwania jest zaburzona (zimny preparat, alkohol dostaje się pod skórę), a także z powodu anabolicznego lokalnego działania samego preparatu. Lipohipertrofia tworzy defekt kosmetyczny, który jest problemem dla pacjentów. Ponadto, z powodu tej wady, wchłanianie leku jest upośledzone. Aby zapobiec rozwojowi lipohipertrofii, zaleca się ciągłą zmianę miejsc wstrzyknięć w tym samym obszarze, pozostawiając co najmniej 1 cm pomiędzy dwoma otworami.

Mogą wystąpić miejscowe reakcje, takie jak ból w miejscu podania.

Interakcja Preparaty insuliny można łączyć ze sobą. Wiele leków może powodować hipo- lub hiperglikemię lub zmieniać reakcję pacjenta z cukrzycą na leczenie. Powinieneś rozważyć interakcję, możliwe przy jednoczesnym stosowaniu insuliny z innymi lekami. Alfa-blokery i beta-adrenomimetiki zwiększają wydzielanie insuliny endogennej i zwiększają działanie leku. Hipoglikemiczne działanie insuliny zwiększenia doustne środki hipoglikemiczne, salicylany, inhibitory MAO (w tym furazolidon, prokarbazyna, selegilina), inhibitory konwertazy angiotensyny, bromokryptyna, oktreotyd, sulfonamidy, sterydy anaboliczne (zwłaszcza oxandrolonu, methandienone) i androgeny (zwiększona wrażliwość na glukozę i zwiększać odporność tkanki na glukagon, co prowadzi do hipoglikemii, szczególnie w przypadku insulinooporności, konieczne może być zmniejszenie dawki insuliny), analogi somatostatyny, guanetydyny, dizo piramidy, klofibrat, ketokonazol, preparaty litu, mebendazol, pentamidyna, pirydoksyny, propoksyfen, fenylobutazon, fluoksetyna, teofilina, fenfluramina, preparaty litu, preparaty wapnia, tetracykliny. Chlorochina, chinidyna, chinina zmniejszają degradację insuliny i mogą zwiększać stężenie insuliny we krwi i zwiększać ryzyko hipoglikemii.

Inhibitory karboanhydrazy (w szczególności acetazolamid), poprzez stymulację trzustkowych komórek β, sprzyjają uwalnianiu insuliny i zwiększają wrażliwość receptorów i tkanek na insulinę; chociaż równoczesne stosowanie tych leków z insuliną może nasilać efekt hipoglikemii, efekt może być nieprzewidywalny.

Liczne leki powodują hiperglikemię u zdrowych ludzi i pogarszają przebieg choroby u pacjentów z cukrzycą. Hipoglikemiczny wpływ insuliny jest osłabiony: leki przeciwwirusowe, asparaginaza, doustne hormonalne środki antykoncepcyjne, glikokortykosteroidy, leki moczopędne (tiazyd, kwas etakrynowy), heparyna, antagoniści H.₂-Receptory sulfinpirazon, trójcykliczne leki przeciwdepresyjne, dobutaminy, izoniazyd, kalcytonina, niacyna, sympatykomimetyki, danazol, klonidyna, CCB, diazoksyd, morfina, fenytoina, hormony wzrostu, hormony tarczycy, pochodne fenotiazyny, nikotyna, etanol.

Glikokortykosteroidy i adrenalina działają przeciwnie do insuliny na tkanki obwodowe. Na przykład długotrwałe stosowanie glikokortykoidów może prowadzić do czasu systemowego hiperglikemię w cukrzycy (cukrzycy) steroidu, które można zaobserwować w około 14% pacjentów otrzymujących kortykosteroidy układowe w ciągu kilku tygodni lub długotrwałe stosowanie kortykosteroidów do stosowania miejscowego. Niektóre leki hamują wydzielanie insuliny bezpośrednio (fenytoina, klonidyna, diltiazem) lub zmniejszając zapasy potasu (diuretyki). Hormony tarczycy przyspieszają metabolizm insuliny.

Najważniejsze i często wpływają na działanie beta-blokerów insuliny, doustnych środków hipoglikemicznych, glukokortykoidów, etanolu, salicylanów.

Etanol hamuje glukoneogenezę w wątrobie. Ten efekt obserwuje się u wszystkich ludzi. W związku z tym należy pamiętać, że nadużywanie napojów alkoholowych na tle insulinoterapii może prowadzić do rozwoju ciężkiego stanu hipoglikemii. Małe ilości alkoholu spożywanego z jedzeniem zwykle nie powodują problemów.

Beta-blokery mogą hamować wydzielanie insuliny, zmieniać metabolizm węglowodanów i zwiększać oporność obwodową na insulinę, co prowadzi do hiperglikemii. Jednak mogą one również hamować działanie katecholamin w glukoneogenezy i glikogenolizy, z ryzykiem wystąpienia ciężkich hipoglikemii u pacjentów z cukrzycą. Co więcej, każdy z blokerów beta-adrenergicznych może maskować objawy adrenergiczne spowodowane obniżeniem poziomu glukozy we krwi (w tym drżenia, kołatania serca), tym samym zakłócając rozpoznanie przez pacjenta hipoglikemii w odpowiednim czasie. Selektywna beta₁-blokery adrenergiczne (w tym acebutolol, atenolol, betaksolol, bisoprolol, metoprolol) wykazują te działania w mniejszym stopniu.

NLPZ i duże dawki salicylanów hamują syntezę prostaglandyny E (która hamuje wydzielanie insuliny endogennej), a tym samym zwiększają podstawowe wydzielanie insuliny, zwiększają wrażliwość komórek β trzustki na glukozę; działanie hipoglikemiczne przy jednoczesnym stosowaniu może wymagać dostosowania dawki NLPZ lub salicylanów i / lub insuliny, zwłaszcza w przypadku długotrwałego wspólnego stosowania.

Obecnie produkuje się znaczną liczbę preparatów insuliny, w tym: pochodzące z trzustki zwierząt i syntetyzowane przez inżynierię genetyczną. Preparatami z wyboru do leczenia insuliną są wysoce oczyszczone insuliny ludzkie o minimalnej antygenowości (aktywność immunogenna), jak również analogi insuliny ludzkiej.

Preparaty insuliny są produkowane w szklanych fiolkach, hermetycznie zamknięte gumowymi korkami z aluminiowym bieżnikiem, w specjalnym tzw. strzykawki insulinowe lub pióra strzykawkowe. Podczas używania wstrzykiwaczy do strzykawek, preparaty są w specjalnych kasetach z fiolkami (penfill).

Opracowuje się donosowe formy insuliny i preparaty insuliny do podawania doustnego. Dzięki połączeniu insuliny z detergentem i podawaniu w postaci aerozolu na błonie śluzowej nosa, osiąga się skuteczne stężenie w osoczu tak szybko, jak przy podawaniu bolusa IV. Produkowane donosowo i doustnie preparaty insuliny są opracowywane lub poddawane próbom klinicznym.